Erforschung von Caspase-Mutationen und posttranslationalen Modifikationen durch molekulare Modellierungsansätze
Summary
Das vorliegende Protokoll verwendet ein biomolekulares Simulationspaket und beschreibt den molekulardynamischen (MD) Ansatz zur Modellierung der Wildtyp-Caspase und ihrer mutierten Formen. Die MD-Methode ermöglicht es, die dynamische Entwicklung der Caspase-Struktur und die möglichen Auswirkungen von Mutationen oder posttranslationalen Modifikationen zu beurteilen.
Abstract
Apoptose ist eine Art programmierter Zelltod, der beschädigte Zellen eliminiert und die Entwicklung und Gewebehomöostase von mehrzelligen Organismen steuert. Caspasen, eine Familie von Cysteinproteasen, spielen eine Schlüsselrolle bei der Apoptose-Initiierung und -Ausführung. Die Reifung der Caspasen und ihre Aktivität wird durch posttranslationale Modifikationen hochdynamisch verfeinert. Um die Auswirkungen posttranslationaler Veränderungen zu beurteilen, werden potenzielle Standorte routinemäßig mit Rückständen mutiert, die für Modifikationen persistent sind. Beispielsweise wird der Serinrest durch Alanin oder Asparaginsäure ersetzt. Solche Substitutionen könnten jedoch die Konformation des aktiven Zentrums der Caspase verändern, was zu Störungen der katalytischen Aktivität und der zellulären Funktionen führt. Darüber hinaus könnten Mutationen anderer Aminosäurereste, die sich in kritischen Positionen befinden, auch die Struktur und Funktionen von Caspasen stören und zu Apoptosestörungen führen. Um die Schwierigkeiten bei der Verwendung mutierter Rückstände zu vermeiden, können molekulare Modellierungsansätze leicht angewendet werden, um die mögliche Wirkung von Aminosäuresubstitutionen auf die Caspase-Struktur abzuschätzen. Das vorliegende Protokoll ermöglicht die Modellierung sowohl der Wildtyp-Caspase als auch ihrer mutierten Formen mit dem biomolekularen Simulationspaket (Amber) und Supercomputeranlagen, um die Wirkung von Mutationen auf die Proteinstruktur und -funktion zu testen.
Introduction
Apoptose ist einer der am besten untersuchten zellulären Prozesse, die die Morphogenese und Gewebehomöostase mehrzelliger Organismen regulieren. Apoptose kann durch eine Vielzahl von externen oder internen Reizen ausgelöst werden, wie die Aktivierung von Todesrezeptoren, Störungen der Zellzyklussignale, DNA-Schäden, endoplasmatischer Retikulumstress (ER) und verschiedene bakterielle und virale Infektionen1. Die Caspasen – wichtige apoptotische Akteure – werden konventionell in zwei Gruppen eingeteilt: Initiatoren (Caspase-2, Caspase-8, Caspase-9 und Caspase-10) und Effektoren (Caspase-3, Caspase-6 und Caspase-7), abhängig von ihrer Domänenstruktur und dem Platz in der Caspase-Kaskade 2,3. Bei Zelltodsignalen interagieren die Initiator-Caspasen mit Adaptermolekülen, die die Nähe induzierte Dimerisierung und Autoprocessing zu einem aktiven Enzym ermöglichen. Die Effektor-Caspasen werden durch Spaltung durch Initiator-Caspasen aktiviert und führen nachgeschaltete Ausführungsschritte durch, indem sie mehrere zelluläre Substrate spalten4.
Die Reifung und Funktion der Initiator- und Effektor-Caspasen werden durch eine Vielzahl verschiedener intrazellulärer Mechanismen reguliert, unter denen die posttranslationale Modifikation eine unverzichtbare Rolle bei der Zelltodmodulation spielt5. Die Zugabe von modifizierenden Gruppen (Phosphorylierung, Nitrosylierung, Methylierung oder Acetylierung) oder Proteinen (Ubiquitinierung oder SUMOylierung) verändert die enzymatische Aktivität von Caspasen oder die Proteinkonformation und -stabilität, die die Apoptose regulieren. Die ortsgerichtete Mutagenese wird häufig angewendet, um die potenziellen posttranslationalen Modifikationsstellen zu untersuchen und ihre Rolle zu erkennen. Eine mutmaßliche Modifikationsstelle wird normalerweise durch eine andere Aminosäure ersetzt, die nicht weiter modifiziert werden kann. So werden potentiell phosphoryliertes Serin und Threonin zu Alanin mutiert, und Lysin-Ubiquitinierungsstellen werden durch Arginin ersetzt. Eine andere Strategie beinhaltet die Substitution einer Aminosäure, die insbesondere posttranslationale Modifikationen nachahmt (z. B. wurden Glutamat und Aspartat verwendet, um phosphoryliertes Serin oder Threonin nachzuahmen)6. Einige dieser Substitutionen, die sich in der Nähe eines aktiven Zentrums oder in kritischen Positionen befinden, könnten jedoch die Caspase-Struktur verändern, die katalytische Aktivität stören und den apoptotischen Zelltod unterdrücken7. Ähnliche Effekte konnten bei tumorassoziierten Missense-Mutationen in Caspase-Genen beobachtet werden. Zum Beispiel führte die tumorassoziierte Mutation von Caspase-6 – R259H – zu Konformationsänderungen von Schleifen in der Substratbindungstasche, wodurch der effiziente katalytische Umsatz von Substraten reduziertwurde 8. Die G325A-Aminosäuresubstitution in Caspase-8, die im Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom identifiziert wurde, könnte die Caspase-8-Aktivität behindern, was zur Modulation des Kernfaktor-kB (NF-kB)-Signalwegs führte und die Tumorgeneseförderte 9.
Um die mögliche Wirkung von Aminosäuresubstitutionen auf Caspase-Struktur und -Funktion zu bewerten, kann molekulare Modellierung angewendet werden. In dieser Arbeit wird der Ansatz der Molekulardynamik (MD) zur Modellierung der Wildtyp-Caspase und ihrer mutierten Formen mit dem biomolekularen Simulationspaket (Amber) beschrieben. Die MD-Methode gibt einen Einblick in die dynamische Entwicklung der Proteinstruktur nach der Einführung von Mutationen. Ursprünglich von Peter Kollmans Gruppe entwickelt, wurde das Amber-Paket zu einem der beliebtesten Softwarewerkzeuge für biomolekulare Simulationen10,11,12,13. Diese Software ist in zwei Teile unterteilt: (1) AmberTools, eine Sammlung von Programmen, die routinemäßig für die Systemvorbereitung (Atomtypzuordnung, Hinzufügen von Wasserstoff und expliziten Wassermolekülen usw.) und die Trajektorienanalyse verwendet werden; und (2) Amber, das sich um das pmemd-Simulationsprogramm dreht. AmberTools ist ein kostenloses Paket (und eine Voraussetzung für die Installation von Amber selbst), während Amber mit einer separaten Lizenz- und Gebührenstruktur vertrieben wird. Parallele Simulationen auf einem Supercomputer und/oder unter Verwendung von Graphics Processing Units (GPUs) können die Leistung für die wissenschaftliche Erforschung der Proteinstrukturdynamik erheblich verbessern14. Die neuesten verfügbaren Softwareversionen sind AmberTools21 und Amber20, aber die beschriebenen Protokolle können auch mit den früheren Versionen verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der beschriebene MD-Ansatz ermöglicht die Modellierung sowohl der Wildtyp- als auch der mutierten Form von Caspase unter Verwendung der biomolekularen Simulationspakete. Einige wichtige Fragen der Methodik werden hier diskutiert. Zunächst muss eine repräsentative Kristallstruktur von Caspase aus der Proteindatenbank ausgewählt werden. Wichtig ist, dass sowohl monomere als auch dimere Formen von Caspase akzeptabel sind. Es ist eine gute Idee, hochauflösende Strukturen mit einer minimalen Anzahl fehlender Rückstände…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der Russian Science Foundation unterstützt (17-75-20102, die Protokollentwicklung). Die im Abschnitt über die repräsentativen Ergebnisse beschriebenen Experimente (Analyse der Phosphorylierung) wurden von der Stockholmer (181301) und der schwedischen (190345) Krebsgesellschaft unterstützt.
Materials
| Amber20 | University of California, San Francisco | Software for molecular dynamics simulation http://ambermd.org |
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| AmberTools21 | University of California, San Francisco | Software for molecular modeling and analysis http://ambermd.org |
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