חקר מוטציות קספזיות ושינוי פוסט-תרגומי על ידי גישות מידול מולקולריות
Summary
הפרוטוקול הנוכחי משתמש בחבילת סימולציה ביומולקולרית ומתאר את גישת הדינמיקה המולקולרית (MD) למידול הקספאז מסוג בר וצורותיו המוטנטיות. שיטת MD מאפשרת להעריך את האבולוציה הדינמית של מבנה הקספאז ואת ההשפעה הפוטנציאלית של מוטציות או שינויים לאחר תרגום.
Abstract
אפופטוזיס הוא סוג של מוות תאי מתוכנת המבטל תאים פגומים ושולט על התפתחות הומאוסטזיס רקמות של אורגניזמים רב תאיים. קספזות, משפחה של פרוטאזות ציסטאין, ממלאות תפקיד מפתח בייזום וביצוע אפופטוזיס. ההבשלה של הקספאזות ופעילותן מכווננת על ידי שינויים פוסט-תרגומיים בצורה דינמית ביותר. כדי להעריך את ההשפעה של שינויים לאחר תרגום, אתרים פוטנציאליים עוברים מוטציה שגרתית עם שאריות המתמשכות לכל שינוי. לדוגמה, שאריות הסרין מוחלפות באלנין או בחומצה אספרטית. עם זאת, תחליפים כאלה יכולים לשנות את הקונפורמציה של האתר הפעיל של הקספאזה, מה שמוביל להפרעות בפעילות הקטליטית ובתפקודים התאיים. יתר על כן, מוטציות של שאריות חומצות אמינו אחרות הממוקמות במיקומים קריטיים עלולות גם לשבור את המבנה והתפקודים של קספאזות ולהוביל להפרעות אפופטוזיס. כדי להימנע מהקשיים הכרוכים בשימוש בשאריות שעברו מוטציה, ניתן ליישם בקלות גישות של מודלים מולקולריים כדי להעריך את ההשפעה הפוטנציאלית של תחליפי חומצות אמינו על מבנה הקספאז. הפרוטוקול הנוכחי מאפשר מידול הן של הקספאז מסוג בר והן של הצורות המוטנטיות שלו עם חבילת הסימולציה הביומולקולרית (Amber) ומתקני מחשבי-על כדי לבחון את ההשפעה של מוטציות על המבנה והתפקוד של החלבון.
Introduction
אפופטוזיס הוא אחד התהליכים התאיים הנחקרים ביותר המווסתים את המורפוגנזה ואת ההומאוסטזיס של הרקמות של אורגניזמים רב-תאיים. אפופטוזיס יכול להיות יזום על ידי מגוון רחב של גירויים חיצוניים או פנימיים, כגון הפעלת קולטני מוות, הפרעה באותות מחזור התא, נזק לדנ”א, מתח רשתית אנדופלסמית (ER) וזיהומים חיידקיים ונגיפים שונים1. הקספאזות – שחקנים אפופטוטיים מרכזיים – מסווגות באופן מסורתי לשתי קבוצות: יוזמים (caspase-2, caspase-8, caspase-9 ו- caspase-10) ואפקטים (caspase-3, caspase-6 ו- caspase-7), בהתאם למבנה התחום שלהם ולמקום במפל הקספאזה 2,3. עם אותות המוות התאים, הקספאזות היוזם מתקשרות עם מולקולות מתאם המאפשרות דימריזציה ועיבוד אוטומטי המושרים על ידי קרבה ליצירת אנזים פעיל. הקספאזות המשפיעות מופעלות באמצעות ביקוע על ידי קספאזות יוזמות ומבצעות שלבי ביצוע במורד הזרם על ידי ביקוע מצעים תאיים מרובים4.
ההתבגרות והתפקוד של הקספאזות היוזם והאפקטים מוסדרות על ידי מספר רב של מנגנונים תוך-תאיים שונים, ביניהם השינוי שלאחר התרגום ממלא תפקיד חיוני במודולציה של מוות תאי5. תוספת של קבוצות משתנות (פוספורילציה, ניטרוסילציה, מתילציה או אצטילציה) או חלבונים (אוביקוויטינציה או SUMOylation) משנה את הפעילות האנזימטית של קספאזות או את הקונפורמציה והיציבות של החלבון המווסתות אפופטוזיס. מוטגנזה מכוונת אתר מיושמת באופן נרחב כדי לחקור את אתרי השינוי הפוטנציאליים שלאחר התרגום ולהבחין בתפקידם. אתר שינוי פוטטיבי מוחלף בדרך כלל על ידי חומצת אמינו אחרת, אשר לא ניתן לשנות עוד יותר. לפיכך, סרין ותראונין שעברו פוספורילציה עוברים מוטציה לאלנין, ואתרי יוביקוויטינציה של ליזין מוחלפים בארגינין. אסטרטגיה נוספת כוללת החלפת חומצת אמינו המחקה במיוחד שינויים לאחר תרגום (למשל, גלוטמט ואספרטט שימשו לחיקוי סרין זרחני או תראונין)6. עם זאת, חלק מהחלפות אלה הממוקמות בקרבת אתר פעיל או במיקומים קריטיים יכולות לשנות את מבנה הקספאזה, להפריע לפעילות הקטליטית ולדכא מוות תאי אפופטוטי7. השפעות דומות ניתן לראות במקרים של מוטציות missense הקשורות לגידול בגנים caspase. לדוגמה, המוטציה הקשורה לגידול של caspase-6 – R259H – גרמה לשינויים קונפורמיים של לולאות בכיס קושר המצע, והפחיתה את המחזור הקטליטי היעיל של מצעים8. תחליפי חומצות האמינו G325A ב-caspase-8 שזוהו בקרצינומה של תאי קשקש בראש ובצוואר עלולים לפגוע בפעילות של קספאז-8, מה שהוביל לאפנון האיתות של גורם גרעיני-kB (NF-kB) וקידם גידולים9.
כדי להעריך את ההשפעה הפוטנציאלית של תחליפי חומצות אמינו על המבנה והתפקוד של קספאז, ניתן ליישם מודלים מולקולריים. גישת הדינמיקה המולקולרית (MD) מתוארת בעבודה זו עבור מידול הקספאזה מסוג בר וצורותיו המוטנטיות באמצעות חבילת הסימולציה הביומולקולרית (Amber). שיטת MD נותנת מבט על האבולוציה הדינמית של מבנה החלבון לאחר הופעת מוטציות. חבילת אמבר, שפותחה במקור על ידי קבוצתו של פיטר קולמן, הפכה לאחד מכלי התוכנה הפופולריים ביותר לסימולציות ביומולקולריות10,11,12,13. תוכנה זו מחולקת לשני חלקים: (1) AmberTools, אוסף של תוכניות המשמשות באופן שגרתי להכנת המערכת (הקצאת סוג אטום, הוספת מימן ומולקולות מים מפורשות וכו ‘) וניתוח מסלול; ו-(2) ענבר, שבמרכזה תוכנית הסימולציה של pmemd. AmberTools היא חבילה חינם (ותנאי מוקדם להתקנת אמבר עצמה), בעוד אמבר מופץ עם רישיון נפרד ומבנה אגרה. סימולציות מקבילות במחשב על ו/או שימוש ביחידות עיבוד גרפיות (GPU) יכולות לשפר באופן משמעותי את הביצועים למחקר המדעי של דינמיקת מבנה חלבונים14. גרסאות התוכנה הזמינות העדכניות ביותר הן AmberTools21 ו- Amber20, אך ניתן להשתמש בפרוטוקולים המתוארים גם עם הגרסאות הקודמות.
Protocol
Representative Results
Discussion
גישת ה-MD המתוארת מאפשרת מידול הן של צורות פראיות והן של צורות מוטנטיות של קספאז באמצעות חבילות הסימולציה הביומולקולרית. מספר נושאים חשובים של המתודולוגיה נדונים כאן. ראשית, יש לבחור מבנה גבישי מייצג של קספאז מתוך בנק נתוני החלבון. חשוב לציין שגם צורות מונומריות וגם דימריות של קספאז מקובלו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מקרן המדע הרוסית (17-75-20102, פיתוח הפרוטוקול). ניסויים המתוארים בסעיף התוצאות המייצגות (ניתוח של זרחון) נתמכו על ידי אגודות הסרטן של שטוקהולם (181301) ושוודיה (190345).
Materials
| Amber20 | University of California, San Francisco | Software for molecular dynamics simulation http://ambermd.org |
|
| AmberTools21 | University of California, San Francisco | Software for molecular modeling and analysis http://ambermd.org |
References
- Olsson, M., Zhivotovsky, B. Caspases and cancer. Cell Death and Differentiation. 18 (9), 1441-1449 (2011).
- Lavrik, I. N., Golks, A., Krammer, P. H. Caspase: Pharmacological manipulation of cell death. Journal of Clinical Investigation. 115 (10), 2665-2672 (2005).
- Degterev, A., Boyce, M., Yuan, J. A decade of caspases. Oncogene. 22 (53), 8543-8567 (2003).
- Pop, C., Salvesen, G. S. Human caspases: Activation, specificity, and regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (33), 21777-21781 (2009).
- Zamaraev, A. V., Kopeina, G. S., Prokhorova, E. A., Zhivotovsky, B., Lavrik, I. N. Post-translational modification of caspases: The other side of apoptosis regulation. Trends in Cell Biology. 27 (5), 322-339 (2017).
- Pearlman, S. M., Serber, Z., Ferrell, J. E. A mechanism for the evolution of phosphorylation sites. Cell. 147 (4), 934-946 (2011).
- Zamaraev, A. V., et al. Requirement for Serine-384 in Caspase-2 processing and activity. Cell Death and Disease. 11 (10), 825 (2020).
- Dagbay, K. B., Hill, M. E., Barrett, E., Hardy, J. A. Tumor-associated mutations in caspase-6 negatively impact catalytic efficiency. 生物化学. 56 (34), 4568-4577 (2017).
- Ando, M., et al. Cancer-associated missense mutations of caspase-8 activate nuclear factor-κB signaling. Cancer Science. 104 (8), 1002-1008 (2013).
- Case, D. A., et al. . AMBER 2020. , (2020).
- Salomon-Ferrer, R., Case, D. A., Walker, R. C. An overview of the Amber biomolecular simulation package. WIREs Computational Molecular Science. 3 (2), 198-210 (2013).
- Roe, D. R., Cheatham, T. E. PTRAJ and CPPTRAJ: Software for processing and analysis of molecular dynamics trajectory data. Journal of Chemical Theory and Computation. 9 (7), 3084-3095 (2013).
- Maier, J. A., et al. ff14SB: Improving the accuracy of protein side chain and backbone parameters from ff99SB. Journal of Chemical Theory and Computation. 11 (8), 3696-3713 (2015).
- Salomon-Ferrer, R., Götz, A. W., Poole, D., Le Grand, S., Walker, R. C. Routine microsecond molecular dynamics simulations with AMBER on GPUs. 2. Explicit solvent particle mesh ewald. Journal of Chemical Theory and Computation. 9 (9), 3878-3888 (2013).
- Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).
- Burley, S. K., et al. RCSB Protein Data Bank: Powerful new tools for exploring 3D structures of biological macromolecules for basic and applied research and education in fundamental biology, biomedicine, biotechnology, bioengineering and energy sciences. Nucleic Acids Research. 49, 437-451 (2021).
- Martinez, X., et al. Molecular graphics: Bridging structural biologists and computer scientists. Structure. 27 (11), 1617-1623 (2019).
- Lee, T. S., et al. GPU-accelerated molecular dynamics and free energy methods in Amber18: Performance enhancements and new features. Journal of Chemical Information and Modeling. 58 (10), 2043-2050 (2018).
- Jäger, R., Zwacka, R. M. The enigmatic roles of caspases in tumor development. Cancers. 2 (4), 1952-1979 (2010).
