Summary

Identificatie en isolatie van burst-forming unit en kolonievormende eenheid Erytroïde voorlopers uit muizenweefsel door flowcytometrie

Published: November 04, 2022
doi:

Summary

Hier beschrijven we een nieuwe flowcytometrische methode voor prospectieve isolatie van vroege burst-forming unit erythroid (BFU-e) en kolonievormende unit erythroid (CFU-e) voorlopers rechtstreeks uit vers beenmerg en milt van muizen. Dit protocol, ontwikkeld op basis van eencellige transcriptomische gegevens, is het eerste dat alle erytroïde voorlopercellen van het weefsel met een hoge zuiverheid isoleert.

Abstract

Vroege erytroïde voorlopers werden oorspronkelijk gedefinieerd door hun kolonievormende potentieel in vitro en ingedeeld in burst-vormende en kolonievormende “eenheden” bekend als BFU-e en CFU-e. Tot voor kort waren methoden voor de directe prospectieve en volledige isolatie van zuivere BFU-e en CFU-e voorlopers uit vers geïsoleerd volwassen muizenbeenmerg niet beschikbaar. Om deze kloof aan te pakken, werd een eencellige RNA-seq (scRNAseq) dataset van het beenmerg van muizen geanalyseerd op de expressie van genen die coderen voor celoppervlakmarkers. Deze analyse werd gecombineerd met cel lot assays, waardoor de ontwikkeling van een nieuwe flowcytometrische benadering mogelijk werd die volledige en zuivere subsets van BFU-e en CFU-e voorlopers in het beenmerg of de milt van muizen identificeert en mogelijk maakt. Deze benadering identificeert ook andere voorlopersubsets, waaronder subsets verrijkt voor basofielen / mestcellen en megakaryocytische potentialen. De methode bestaat uit het labelen van verse beenmerg- of miltcellen met antilichamen gericht op Kit en CD55. Voorlopers die beide markers uitdrukken, worden vervolgens onderverdeeld in vijf hoofdpopulaties. Populatie 1 (P1 of CFU-e, Kit+ CD55+ CD49fmed/low CD105med/high CD71med/high) bevat alle CFU-e voorlopers en kan verder worden onderverdeeld in respectievelijk P1-low (CD71med CD150high) en P1-hi (CD71high CD150low), overeenkomend met respectievelijk vroege en late CFU-e; Populatie 2 (P2 of BFU-e, Kit+ CD55+ CD49fmed/low CD105med/high CD71low CD150high) bevat alle BFU-e voorlopers; Populatie P3 (P3, Kit+ CD55+ CD49fmed/high CD105med/low CD150low CD41low) is verrijkt voor basofiele/mestcelvoorlopers; Populatie 4 (P4, Kit+ CD55+ CD49fmed/high CD105med/low CD150high CD41+) is verrijkt voor megakaryocytische voorlopers; en Populatie 5 (P5, Kit+ CD55+ CD49fmed/high CD105med/low CD150high CD41) bevat voorlopers met erytroïde, basofiele/mestcel en megakaryocytisch potentieel (EBMP) en erytroïde/ megakaryocytische/ basofiel-bevooroordeelde multipotentiële voorlopers (MPP’s). Deze nieuwe benadering maakt een grotere precisie mogelijk bij het analyseren van erytroïde en andere hematopoëtische voorlopers en maakt ook verwijzing naar transcriptoominformatie mogelijk voor elke flowcytometrisch gedefinieerde populatie.

Introduction

Erytropoëse kan worden onderverdeeld in twee hoofdfasen: vroege erytropoëse en erytroïde terminale differentiatie (figuur 1)1,2,3. In vroege erytropoëse binden hematopoëtische stamcellen zich aan de erytroïde afstamming en geven ze aanleiding tot vroege erytroïde voorlopers, die voor het eerst werden geïdentificeerd in de jaren 1970 op basis van hun kolonievormend potentieel in halfvast medium 4,5,6,7,8,9 . In grote lijnen zijn erytroïde voorlopers verdeeld in twee categorieën: eerdere voorlopercellen die elk aanleiding geven tot een “burst” (een groot aggregaat van kleinere erytroïde celclusters), genaamd “burst-forming unit erythroid” of BFU-e 4,5,6; en hun nakomelingen, die elk een enkele, kleine erytroïde celcluster of kolonie vormen, genaamd “kolonievormende eenheid erytroïde” of CFU-e 7,8,9. BFU-e en CFU-e brengen nog geen terminale erytroïde genen tot expressie en zijn morfologisch niet herkenbaar. Na een aantal zelfvernieuwings- of expansieceldelingen ondergaat de CFU-e een transcriptionele schakelaar waarbij erytroïde genen zoals globines worden geïnduceerd, waardoor deze overgaat in erytroïde terminale differentiatie (ETD)1,10. Tijdens ETD ondergaan erytroblasten drie tot vijf rijpingsceldelingen voordat ze enucleeren om reticulocyten te vormen, die rijpen tot rode bloedcellen.

Erytroblasten tijdens terminale differentiatie werden oorspronkelijk geclassificeerd op basis van hun morfologie in proerytroblasten, basofiele, polychromatische en orthochromatische. De komst van flowcytometrie maakte hun prospectieve sortering en isolatie mogelijk op basis van celgrootte (gemeten door voorwaartse spreiding, FSC) en twee celoppervlakmarkers, CD71 en Ter11911,12,13 (figuur 1). Deze en soortgelijke flowcytometrische benaderingen14 hebben een revolutie teweeggebracht in het onderzoek naar de moleculaire en cellulaire aspecten van ETD, waardoor ontwikkelingsstadiumspecifieke analyse van erytroblasten in vivo en in vitro 10,15,16,17,18,19,20 mogelijk is. De CD71/Ter119-benadering wordt nu routinematig gebruikt bij de analyse van erytroïde precursoren.

Tot voor kort is een vergelijkbare, toegankelijke flowcytometrische benadering voor directe, zeer zuivere prospectieve isolatie van CFU-e en BFU-e uit muizenweefsel onderzoekers ontgaan. In plaats daarvan hebben onderzoekers flowcytometrische strategieën gebruikt die slechts een fractie van deze voorlopers isoleren, vaak in de aanwezigheid van niet-erytroïde cellen die co-zuiveren binnen dezelfde flowcytometrische subsets21. Bijgevolg was het onderzoek van BFU-e en CFU-e beperkt tot in vitro differentiatiesystemen die BFU-e en CFU-e afleiden en versterken van eerdere beenmergvoorlopers. Het is dan mogelijk om flowcytometrische strategieën toe te passen die CFU-e onderscheiden van BFU-e in deze erytroïde voorloperverrijkte culturen22,23. Een alternatieve benadering maakt gebruik van foetale CFU-e en BFU-e, die sterk verrijkt zijn in de Ter119-negatieve fractie van de foetale lever van de muis halverwege de zwangerschap 10,24,25. Geen van deze benaderingen maakt echter het onderzoek van volwassen BFU-e en CFU-e in hun fysiologische toestand in vivo mogelijk. De omvang van de uitdaging kan worden gewaardeerd wanneer eraan wordt herinnerd dat, op basis van kolonievormingstests, deze cellen aanwezig zijn in het volwassen beenmerg met een frequentie van respectievelijk slechts 0,025% en 0,3%6.

Het hier beschreven protocol is een nieuwe flowcytometrische benadering op basis van eencellige transcriptomische analyse van vers geoogste Kit+ beenmergcellen van muizen (Kit wordt uitgedrukt door alle vroege voorloperpopulaties van het beenmerg)1. Onze aanpak bevat enkele celoppervlakmarkers die al in gebruik waren door Pronk et al.21,26. Eencellige transcriptomen werden gebruikt om combinaties van celoppervlakmarkers te bepalen die erytroïde en andere vroege hematopoëtische voorlopercellen identificeren (figuur 2). In het bijzonder kan de CD55+ fractie van lineage-negatieve (Lin) Kit+ cellen worden onderverdeeld in vijf populaties, waarvan er drie aaneengesloten segmenten van het erytroïde traject opleveren (figuur 2). De transcriptomische identiteiten van elk van deze populaties werden bevestigd door sortering, gevolgd door scRNAseq en projectie van de gesorteerde eencellige transcriptomen terug op de oorspronkelijke transcriptomische kaart (de genexpressie in elk van de vijf populaties en de volledige beenmergdataset kan worden onderzocht in https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html)1 . Het potentieel van het lot van elk van de populaties werd bevestigd met behulp van traditionele kolonievormingstests (figuur 2), evenals een nieuwe high-throughput single-cell fate assay 1,27. Deze analyses tonen aan dat de nieuwe flowcytometrische benadering resulteert in een zeer zuivere isolatie van alle BFU-e en CFU-e voorlopers van vers volwassen beenmerg en milt. In het bijzonder bevat populatie 1 (P1) alleen CFU-e en geen andere hematopoëtische voorlopers, en populatie 2 (P2) bevat alle BFU-e-voorlopers van het beenmerg en een klein aantal CFU-e, maar geen andere voorlopers1. Het gedetailleerde protocol hieronder wordt verder geïllustreerd met een voorbeeldexperiment bij muizen die werden geïnjecteerd met een zoutoplossing of met het erytropoësestimulerend hormoon erytropoëtine (Epo).

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de dierprotocollen A-1586 en 202200017 goedgekeurd door de Chan Medical School Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Massachusetts. OPMERKING: Twee protocollen worden hier beschreven: ten eerste, flowcytometrische analyse (sectie 1), gevolgd door protocolaanpassingen voor flowcytometrische sortering (sectie 2). Het onderstaande protocol maakt gebruik van een flowcytometer/sorteerder met 10 kanalen. Een voo…

Representative Results

Het protocol beschrijft een flowcytometrische benadering om BFU-es en CFU-es te identificeren in vers geoogst beenmerg- en miltcellen. Het begint met het oogsten van verse BM en milt van muizen en het onmiddellijk op ijs leggen van het weefsel. Alle procedures worden in de kou uitgevoerd om de levensvatbaarheid van de cel te behouden. Cellen worden gelabeld met een “lineage” antilichaamcocktail die de uitsluiting mogelijk maakt van alle cellen die markers van gedifferentieerde bloedlijnen tot expressie brengen (de FITC-L…

Discussion

Het vermogen om BFU-e en CFU-e voorlopers prospectief te isoleren rechtstreeks uit vers weefsel met hoge zuiverheid was eerder onderzoekers ontgaan. Onze nieuwe aanpak, gevalideerd met scRNAseq en cell fate assays 1,27, biedt nu de tools om dit te doen.

Er zijn een aantal belangrijke punten voor het succesvol uitvoeren van zowel de sorteer- als de analytische protocollen. Eerst moeten de cellen worden gesponnen bij 900 x g om …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk wordt ondersteund door NIH-subsidies R01DK130498, R01DK120639 en R01HL141402

Materials

0.5 M EDTA, pH 8.0 Life Technologies 15575020
1000 µL large orifice tips USA sceintific 1011-9000
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD55 (DAF) Antibody BioLegend 131806
APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) Antibody BioLegend 105826
Biotin-CD11b BD Biosciences 557395 M1/70 (clone)
Biotin-CD19 BD Biosciences 553784 1D3 (clone)
Biotin-CD4 BD Biosciences BDB553045 RM4-5 (clone)
Biotin-CD8a BD Biosciences BDB553029 53-6.7 (clone)
Biotin-F4/80 Biolegend 123106 BM8 (clone)
Biotin-Ly-6G and Ly-6C BD Biosciences 553125 RB6-8C5 (clone)
Biotin-TER-119 BD Biosciences 553672 TER-119 (clone)
Bovine Serum Albumin Sigma aldritch A1470
Brilliant Violet 421 anti-human/mouse CD49f Antibody BioLegend 313624
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD41 Antibody BioLegend 133921
Brilliant Violet 650 anti-mouse CD150 (SLAM) Antibody BioLegend 115931
BUV395 Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells BD Biosciences 563827
ChromPure Rabbit IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch Laboratories 011-000-003
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Life Technologies D1306
Digital DIVA hardware and software for LSR II BD Biosciences
FITC anti-mouse F4/80 Antibody BioLegend 123108
FITC Rat Anti-CD11b BD Biosciences 557396
FITC Rat Anti-Mouse CD19 BD Biosciences 553785
FITC Rat Anti-Mouse CD4 BD Biosciences 553047
FITC Rat Anti-Mouse CD8a BD Biosciences 553031
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and LY-6C BD Biosciences 553127
FlowJo software  FlowJo version 10 Flow cytometer analysis software
LSR II digital multiparameter flow cytometer analyzer BD Biosciences Flow cytometer 
NewlineNY Stainless Steel Hand Masher & Bowl, Mortar and Pestle Set Amazon
Normal rat serum Stem Cell Technologies 13551
PE anti-mouse CD105 Antibody BioLegend 120408
PE/Cyanine7 anti-mouse CD71 Antibody BioLegend 113812
Phosphate Buffered Saline, 10x Solution Fisher scientific BP3994
Streptavidin Nanobeads BioLegend 480016 Magnetic beads

References

  1. Tusi, B. K., et al. Population snapshots predict early haematopoietic and erythroid hierarchies. Nature. 555 (7694), 54-60 (2018).
  2. Socolovsky, M. The role of specialized cell cycles during erythroid lineage development: Insights from single-cell RNA sequencing. International Journal of Hematology. 116 (2), 163-173 (2022).
  3. Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development. WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504 (2021).
  4. Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M., Heath, D. S., Robinson, W. A. Properties of Cells that Produce Erythrocytic Colonies In Vitro. Hemopoiesis in Culture. , (1974).
  5. Heath, D. S., Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M. Separation of the erythropoietin-responsive progenitors BFU-E and CFU-E in mouse bone marrow by unit gravity sedimentation. Blood. 47 (5), 777-792 (1976).
  6. Iscove, N. N., Sieber, F. Erythroid progenitors in mouse bone marrow detected by macroscopic colony formation in culture. Experimental Hematology. 3 (1), 32-43 (1975).
  7. Gregory, C. J., McCulloch, E. A., Till, J. E. Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: State of differentiation. Journal of Cell Physiology. 81 (3), 411-420 (1973).
  8. Gregory, C. J., Tepperman, A. D., McCulloch, E. A., Till, J. E. Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: Response of normal and genetically anemic W-W-V mice to manipulations of the erythron. Journal of Cell Physiology. 84 (1), 1-12 (1974).
  9. Gregory, C. J. Erythropoietin sensitivity as a differentiation marker in the hemopoietic system: studies of three erythropoietic colony responses in culture. Journal of Cell Physiology. 89 (2), 289-301 (1976).
  10. Pop, R., et al. A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression. PLoS Biology. 8 (9), 1000484 (2010).
  11. Koulnis, M., et al. Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay. Journal of Visualized Experiments. (54), e2809 (2011).
  12. Liu, Y., et al. Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in vivo. Blood. 108 (1), 123-133 (2006).
  13. Socolovsky, M., et al. Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts. Blood. 98 (12), 3261-3273 (2001).
  14. Chen, K., et al. Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17413-17418 (2009).
  15. Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development. WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504 (2020).
  16. Hidalgo, D., et al. EpoR stimulates rapid cycling and larger red cells during mouse and human erythropoiesis. Nature Communications. 12 (1), 7334 (2021).
  17. Porpiglia, E., Hidalgo, D., Koulnis, M., Tzafriri, A. R., Socolovsky, M. Stat5 signaling specifies basal versus stress erythropoietic responses through distinct binary and graded dynamic modalities. PLoS Biology. 10 (8), 1001383 (2012).
  18. Koulnis, M., et al. Contrasting dynamic responses in vivo of the Bcl-xL and Bim erythropoietic survival pathways. Blood. 119 (5), 1228-1239 (2012).
  19. Shearstone, J. R., et al. Global DNA demethylation during mouse erythropoiesis in vivo. Science. 334 (6057), 799-802 (2011).
  20. Koulnis, M., Liu, Y., Hallstrom, K., Socolovsky, M. Negative autoregulation by Fas stabilizes adult erythropoiesis and accelerates its stress response. PLoS One. 6 (7), 21192 (2011).
  21. Pronk, C. J., et al. Elucidation of the phenotypic, functional, and molecular topography of a myeloerythroid progenitor cell hierarchy. Cell Stem Cell. 1 (4), 428-442 (2007).
  22. Dolznig, H., et al. Expansion and differentiation of immature mouse and human hematopoietic progenitors. Methods in Molecular Medicine. 105, 323-344 (2005).
  23. Li, J., et al. Isolation and transcriptome analyses of human erythroid progenitors: BFU-E and CFU-E. Blood. 124 (24), 3636-3645 (2014).
  24. Zhang, J., Socolovsky, M., Gross, A. W., Lodish, H. F. Role of Ras signaling in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: Functional analysis by a flow cytometry-based novel culture system. Blood. 102 (12), 3938-3946 (2003).
  25. Flygare, J., Rayon Estrada, V., Shin, C., Gupta, S., Lodish, H. F. HIF1alpha synergizes with glucocorticoids to promote BFU-E progenitor self-renewal. Blood. 117 (12), 3435-3444 (2011).
  26. Pronk, C. J., Attema, J., Rossi, D. J., Sigvardsson, M., Bryder, D. Deciphering developmental stages of adult myelopoiesis. Cell Cycle. 7 (6), 706-713 (2008).
  27. Khoramian Tusi, B., Socolovsky, M. High-throughput single-cell fate potential assay of murine hematopoietic progenitors in vitro. Experimental Hematology. 60, 21-29 (2018).
  28. Erslev, A. J., Caro, J. Erythropoietin titers in response to anemia or hypoxia. Blood Cells. 13 (1-2), 207-216 (1987).
  29. Koury, M. J., Bondurant, M. C. The molecular mechanism of erythropoietin action. European Journal of Biochemistry. 210 (3), 649-663 (1992).

Play Video

Cite This Article
Swaminathan, A., Hwang, Y., Winward, A., Socolovsky, M. Identification and Isolation of Burst-Forming Unit and Colony-Forming Unit Erythroid Progenitors from Mouse Tissue by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (189), e64373, doi:10.3791/64373 (2022).

View Video