Summary

Identifizierung und Isolierung von Burst-bildenden Einheiten und koloniebildenden Einheiten erythroider Vorläuferzellen aus Mausgewebe mittels Durchflusszytometrie

Published: November 04, 2022
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Summary

Hier beschreiben wir eine neuartige durchflusszytometrische Methode zur prospektiven Isolierung von Vorläuferzellen der frühen Burst-bildenden Einheit erythroid (BFU-e) und der koloniebildenden Einheit erythroid (CFU-e) direkt aus frischem Knochenmark und Milz der Maus. Dieses Protokoll, das auf der Grundlage von Einzelzell-Transkriptomdaten entwickelt wurde, ist das erste, das alle erythroiden Vorläuferzellen des Gewebes mit hoher Reinheit isoliert.

Abstract

Frühe erythroide Vorläufer wurden ursprünglich durch ihr koloniebildendes Potenzial in vitro definiert und in burstbildende und koloniebildende “Einheiten” eingeteilt, die als BFU-e und CFU-e bekannt sind. Bis vor kurzem gab es keine Methoden zur direkten prospektiven und vollständigen Isolierung von reinen BFU-e- und CFU-e-Vorläuferzellen aus frisch isoliertem adultem Mausknochenmark. Um diese Lücke zu schließen, wurde ein Einzelzell-RNA-seq-Datensatz (scRNAseq) des Knochenmarks von Mäusen auf die Expression von Genen analysiert, die für Zelloberflächenmarker kodieren. Diese Analyse wurde mit Zellschicksalstests kombiniert, was die Entwicklung eines neuartigen durchflusszytometrischen Ansatzes ermöglicht, der die Identifizierung und Isolierung vollständiger und reiner Untergruppen von BFU-e- und CFU-e-Vorläuferzellen im Knochenmark oder in der Milz der Maus ermöglicht. Dieser Ansatz identifiziert auch andere Vorläufer-Untergruppen, einschließlich Untergruppen, die für basophile/Mastzell- und megakaryozytäre Potentiale angereichert sind. Die Methode besteht darin, frische Knochenmark- oder Milzzellen mit Antikörpern zu markieren, die gegen Kit und CD55 gerichtet sind. Vorläufer, die diese beiden Marker exprimieren, werden dann in fünf Hauptpopulationen unterteilt. Population 1 (P1 oder CFU-e, Kit+ CD55+ CD49f med/low CD105 med/high CD71 med/high) enthält alle CFU-e-Vorläufer und kann weiter unterteilt werden in P1-low (CD71med CD150 high) und P1-hi (CD71 high CD150low), entsprechend frühen bzw. späten CFU-e; Population 2 (P2 oder BFU-e, Kit+ CD55+ CD49f med/low CD105 med/high CD71low CD150high) enthält alle BFU-e-Vorläufer; Die Population P3 (P3, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105 med/low CD150 low CD41low) ist für basophile/mastzellige Vorläuferzellen angereichert; Population 4 (P4, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105med/low CD150high CD41+) ist für megakaryozytäre Vorläuferzellen angereichert; und Population 5 (P5, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105med/low CD150high CD41-) enthält Vorläuferzellen mit erythroidem, basophilem/mastzelligem und megakaryozytärem Potential (EBMP) und erythroiden/megakaryozytären/basophil-biased Multipotential-Progenitoren (MPPs). Dieser neuartige Ansatz ermöglicht eine höhere Präzision bei der Analyse von erythroiden und anderen hämatopoetischen Vorläuferzellen und ermöglicht auch die Referenzierung von Transkriptominformationen für jede durchflusszytometrisch definierte Population.

Introduction

Die Erythropoese kann in zwei Hauptphasen unterteilt werden: frühe Erythropoese und erythroide terminale Differenzierung (Abbildung 1)1,2,3. Bei der frühen Erythropoese binden sich hämatopoetische Stammzellen an die erythroide Linie und führen zu frühen erythroiden Vorläuferzellen, die erstmals in den 1970er Jahren aufgrund ihres koloniebildenden Potenzials im halbfesten Medium 4,5,6,7,8,9 identifiziert wurden . Im Großen und Ganzen werden erythroide Vorläuferzellen in zwei Kategorien unterteilt: frühere Vorläufer, die jeweils zu einem “Burst” (einem großen Aggregat kleinerer erythroider Zellverbände) führen, der als “burst-bildende Einheit Erythroid” oder BFU-e 4,5,6 bezeichnet wird; und ihre Nachkommen, die jeweils einen einzelnen, kleinen erythroiden Zellhaufen oder eine Kolonie bilden, die als “koloniebildende Einheit Erythroid” oder CFU-e 7,8,9 bezeichnet wird. BFU-e und CFU-e exprimieren noch keine terminalen erythroiden Gene und sind morphologisch nicht erkennbar. Nach einer Reihe von Selbsterneuerungs- oder Expansionszellteilungen durchläuft die CFU-e einen Transkriptionsschalter, bei dem erythroide Gene wie Globine induziert werden, wodurch sie in eine erythroide terminale Differenzierung (ETD) übergeht1,10. Während der ETD durchlaufen Erythroblasten drei bis fünf reifende Zellteilungen, bevor sie zu Retikulozyten enukleieren, die zu roten Blutkörperchen heranreifen.

Erythroblasten während der terminalen Differenzierung wurden ursprünglich aufgrund ihrer Morphologie in Proerythroblasten, basophile, polychromatische und orthochromatische eingeteilt. Das Aufkommen der Durchflusszytometrie ermöglichte ihre prospektive Sortierung und Isolierung basierend auf der Zellgröße (gemessen durch Vorwärtsstreuung, FSC) und zwei Zelloberflächenmarkern, CD71 und Ter11911,12,13 (Abbildung 1). Dieser und ähnliche durchflusszytometrische Ansätze 14 haben die Untersuchung der molekularen und zellulären Aspekte der ETD revolutioniert und ermöglichen eine entwicklungsstadienspezifische Analyse von Erythroblasten in vivo und in vitro 10,15,16,17,18,19,20. Der CD71/Ter119-Ansatz wird heute routinemäßig in der Analyse von erythroiden Vorstufen eingesetzt.

Bis vor kurzem war ein ähnlicher, zugänglicher durchflusszytometrischer Ansatz für die direkte, hochreine prospektive Isolierung von CFU-e und BFU-e aus Mausgewebe den Forschern entgangen. Stattdessen haben die Forscher durchflusszytometrische Strategien verwendet, die nur einen Bruchteil dieser Vorläuferzellen isolieren, oft in Gegenwart von nicht-erythroiden Zellen, die innerhalb derselben durchflusszytometrischen Untergruppen co-reinigen21. Folglich beschränkte sich die Untersuchung von BFU-e und CFU-e auf In-vitro-Differenzierungssysteme, die BFU-e und CFU-e von früheren Vorläuferzellen des Knochenmarks ableiten und amplifizieren. Es ist dann möglich, durchflusszytometrische Strategien anzuwenden, die CFU-e von BFU-e in diesen erythroid-mit Vorläuferzellen angereicherten Kulturen unterscheiden22,23. Ein alternativer Ansatz verwendet fetale CFU-e und BFU-e, die in der Mitte der Schwangerschaft stark mit der Ter119-negativen Fraktion der fetalen Leber der Maus angereichert sind 10,24,25. Keiner dieser Ansätze erlaubt es jedoch, adulte BFU-e und CFU-e in ihrem physiologischen Zustand in vivo zu untersuchen. Das Ausmaß der Herausforderung kann eingeschätzt werden, wenn man sich daran erinnert, dass diese Zellen auf der Grundlage von Koloniebildungstests im adulten Knochenmark mit einer Häufigkeit von nur 0,025% bzw. 0,3% vorhanden sind6.

Das hier beschriebene Protokoll ist ein neuartiger durchflusszytometrischer Ansatz, der auf einer einzelzelligen transkriptomischen Analyse von frisch geernteten Kit+ Maus-Knochenmarkzellen basiert (Kit wird von allen frühen Vorläuferpopulationen des Knochenmarks exprimiert)1. Unser Ansatz enthält einige Zelloberflächenmarker, die bereits von Pronk et al.21,26 verwendet wurden. Einzelzell-Transkriptome wurden verwendet, um Kombinationen von Zelloberflächenmarkern zu bestimmen, die erythroide und andere frühe hämatopoetische Vorläuferzellen identifizieren (Abbildung 2). Insbesondere kann der CD55+-Anteil von Lineage-negativen (Lin-) Kit+-Zellen in fünf Populationen unterteilt werden, von denen drei zusammenhängende Segmente der erythroiden Trajektorie ergeben (Abbildung 2). Die transkriptomischen Identitäten jeder dieser Populationen wurden durch Sortierung bestätigt, gefolgt von scRNAseq und Projektion der sortierten Einzelzell-Transkriptome zurück auf die ursprüngliche transkriptomische Karte (die Genexpression in jeder der fünf Populationen und der gesamte Knochenmarkdatensatz können in https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html untersucht werden)1 . Das Zellschicksalspotenzial jeder der Populationen wurde mit traditionellen Koloniebildungstests (Abbildung 2) sowie einem neuartigen Hochdurchsatz-Einzelzell-Schicksalstestbestätigt 1,27. Diese Analysen zeigen, dass der neuartige durchflusszytometrische Ansatz zu einer hochreinen Isolierung aller BFU-e- und CFU-e-Vorläuferzellen von frischem adultem Knochenmark und Milz führt. Insbesondere enthält Population 1 (P1) nur CFU-e und keine anderen hämatopoetischen Vorläufer, und Population 2 (P2) enthält alle BFU-e-Vorläufer des Knochenmarks und eine kleine Anzahl von CFU-e, aber keine anderen Vorläufer1. Das detaillierte Protokoll unten wird mit einem Beispielexperiment an Mäusen veranschaulicht, denen entweder Kochsalzlösung oder das Erythropoese-stimulierende Hormon Erythropoietin (Epo) injiziert wurden.

Protocol

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Tierprotokollen A-1586 durchgeführt und 202200017 vom Institutional Animal Care and Use Committee der Chan Medical School der University of Massachusetts genehmigt. ANMERKUNG: Hier werden zwei Protokolle beschrieben: Erstens die durchflusszytometrische Analyse (Abschnitt 1), gefolgt von Protokollanpassungen für die durchflusszytometrische Sortierung (Abschnitt 2). Das folgende Protokoll verwendet ein Durchflusszytometer/-sortiergerät mit 1…

Representative Results

Das Protokoll beschreibt einen durchflusszytometrischen Ansatz zur Identifizierung von BFU-es und CFU-es in frisch geernteten Knochenmark- und Milzzellen. Es beginnt mit der Ernte von frischem BM und Milz von Mäusen und dem sofortigen Aufbringen des Gewebes auf Eis. Alle Verfahren werden in der Kälte durchgeführt, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten. Die Zellen werden mit einem “Abstammungs”-Antikörper-Cocktail markiert, der den Ausschluss aller Zellen ermöglicht, die Marker differenzierter Blutlinien exp…

Discussion

Die Fähigkeit, BFU-e- und CFU-e-Vorläufer prospektiv direkt aus frischem Gewebe mit hoher Reinheit zu isolieren, war den Forschern bisher entgangen. Unser neuartiger Ansatz, der mit scRNAseq und Zellschicksalstests 1,27 validiert wurde, bietet nun die Werkzeuge dafür.

Es gibt eine Reihe von Schlüsselpunkten für die erfolgreiche Ausführung sowohl der Sortier- als auch der Analyseprotokolle. Zuerst müssen die Zellen bei 900 x

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wird durch die NIH-Zuschüsse R01DK130498, R01DK120639 und R01HL141402 unterstützt

Materials

0.5 M EDTA, pH 8.0 Life Technologies 15575020
1000 µL large orifice tips USA sceintific 1011-9000
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD55 (DAF) Antibody BioLegend 131806
APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) Antibody BioLegend 105826
Biotin-CD11b BD Biosciences 557395 M1/70 (clone)
Biotin-CD19 BD Biosciences 553784 1D3 (clone)
Biotin-CD4 BD Biosciences BDB553045 RM4-5 (clone)
Biotin-CD8a BD Biosciences BDB553029 53-6.7 (clone)
Biotin-F4/80 Biolegend 123106 BM8 (clone)
Biotin-Ly-6G and Ly-6C BD Biosciences 553125 RB6-8C5 (clone)
Biotin-TER-119 BD Biosciences 553672 TER-119 (clone)
Bovine Serum Albumin Sigma aldritch A1470
Brilliant Violet 421 anti-human/mouse CD49f Antibody BioLegend 313624
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD41 Antibody BioLegend 133921
Brilliant Violet 650 anti-mouse CD150 (SLAM) Antibody BioLegend 115931
BUV395 Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells BD Biosciences 563827
ChromPure Rabbit IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch Laboratories 011-000-003
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Life Technologies D1306
Digital DIVA hardware and software for LSR II BD Biosciences
FITC anti-mouse F4/80 Antibody BioLegend 123108
FITC Rat Anti-CD11b BD Biosciences 557396
FITC Rat Anti-Mouse CD19 BD Biosciences 553785
FITC Rat Anti-Mouse CD4 BD Biosciences 553047
FITC Rat Anti-Mouse CD8a BD Biosciences 553031
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and LY-6C BD Biosciences 553127
FlowJo software  FlowJo version 10 Flow cytometer analysis software
LSR II digital multiparameter flow cytometer analyzer BD Biosciences Flow cytometer 
NewlineNY Stainless Steel Hand Masher & Bowl, Mortar and Pestle Set Amazon
Normal rat serum Stem Cell Technologies 13551
PE anti-mouse CD105 Antibody BioLegend 120408
PE/Cyanine7 anti-mouse CD71 Antibody BioLegend 113812
Phosphate Buffered Saline, 10x Solution Fisher scientific BP3994
Streptavidin Nanobeads BioLegend 480016 Magnetic beads

References

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Swaminathan, A., Hwang, Y., Winward, A., Socolovsky, M. Identification and Isolation of Burst-Forming Unit and Colony-Forming Unit Erythroid Progenitors from Mouse Tissue by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (189), e64373, doi:10.3791/64373 (2022).

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