使用数字微滴PCR定量环状RNA
Summary
该协议描述了数字液滴PCR（dd-PCR）的详细方法，用于使用不同的引物精确定量细胞中的环状RNA（circRNA）水平。
Abstract
数字液滴聚合酶链反应（dd-PCR）是最灵敏的定量方法之一;它将反应分馏成近 20，000 个油包水液滴，PCR 发生在单个液滴中。与传统的实时qPCR相比，dd-PCR具有多个优势，包括检测低丰度靶标的准确性更高，省略了定量的参考基因，消除了样品的技术重复，以及对样品中的抑制剂表现出高弹性。最近，dd-PCR已成为准确定量靶DNA或RNA以进行基因表达分析和诊断的最流行的方法之一。环状RNA（circRNA）是最近发现的共价闭合RNA分子的大家族，缺乏5’和3’末端。它们已被证明通过充当RNA结合蛋白和microRNA的海绵来调节基因表达。此外，circRNA分泌到体液中，它们对核酸外切酶的抗性使它们成为疾病诊断的生物标志物。本文旨在展示如何进行不同的引物设计、RNA 提取、cDNA 合成和 dd-PCR 分析，以准确定量细胞中的特定环状 RNA （circRNA） 水平。总之，我们证明了使用dd-PCR对circRNA的精确定量。
Introduction
RNA测序技术和新颖计算算法的最新进展发现了不断增长的非编码RNA家族的新成员，称为环状RNA（circRNA）1。顾名思义，circRNA是一类没有自由末端的单链RNA分子。它们由称为反向剪接的非规范头到尾剪接形成，其中上游剪接受体位点与下游剪接供体位点共价连接，形成稳定的RNA环1，2。这个过程可以由几个因素介导，包括存在于环状外显子上游和下游的倒置Alu重复元件，或者可以通过一些剪接因子或RNA结合蛋白（RBP）介导2，3。仅由外显子或内含子序列产生的环状RNA被归类为外显子circRNA和环状内含子RNA或ci-RNA，而一些外显子circRNA保留内含子并称为外显子-内含子circRNA（EIcircRNA）3，4。circRNA的功能是多方面的，包括海绵miRNA和/或RBP，调节转录以及通过翻译成肽3，5，6，7来调节细胞功能。一些报告强调了circRNA在各种疾病和生理过程中的重要性8。此外，组织特异性表达模式和对核酸外切酶消化的抗性使其成为疾病诊断的功能生物标志物，也可以用作合适的治疗靶点8。考虑到其在调节健康和疾病方面的重要性，准确定量circRNA表达是当务之急。
已经开发了几种生化方法来量化生物样品中的circRNA9。circRNA定量最方便和最广泛接受的方法之一是逆转录，然后使用不同的引物对进行定量聚合酶链反应（RT-qPCR）10。然而，与线性mRNA相比，大多数circRNA的丰度较低，这使得量化它们具有挑战性11。为了克服这个问题，我们试图使用数字微滴PCR（dd-PCR）来准确量化给定样品中circRNA的数量。dd-PCR是一种遵循微流体原理的先进PCR技术;它在油中产生多个水滴，并且PCR作为单独的反应在每个液滴中发生12。反应发生在单个液滴中，并使用液滴读数器进行分析，该读数器给出了目标基因的正或负液滴数12。这是准确定量目的基因的最灵敏技术，即使给定样本中只有一个拷贝。对抑制剂的敏感性降低，精度更高，并且省略了用于定量的参考基因，使其比传统的qPCR13，14，15更具优势。它已被广泛用作对感兴趣的基因进行绝对定量的研究和诊断工具16，17。在这里，我们描述了使用不同引物分化小鼠C2C12肌管和增殖小鼠C2C12成肌细胞中circRNA定量的详细dd-PCR协议。
Protocol
Representative Results
Discussion
在过去的十年中，随着高通量测序技术的发现，CircRNA研究得到了发展。因此，它被认为是未来RNA疗法的潜在分子。此外，已知它可以作为多种疾病的生物标志物，包括癌症和心血管疾病4，8。然而，circRNA的鉴定是棘手的，因为它的丰度低，并且只有一个特定的背剪接连接序列，将其与亲本mRNA9区分开来。自发现以来?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了生命科学研究所的校内资助，DBT研究资助（BT / PR27622 / MED/30 / 1961 / 2018）和授予Amaresh C. Panda的威康信托基金会/ DBT印度联盟奖学金[IA / I / 18 / 2 / 504017]的支持。我们感谢其他实验室成员校对本文。
Materials
| 1.5 ml microcentifuge tube | Tarson | 500010 | |
| 0.2 ml tube strips with cap | Tarson | 610020, 510073 | |
| Filter Tips | Tarson | 528104 | |
| DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977023 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Cell scrapper | HiMedia | TCP223 | |
| Chloroform | SRL | 96764 | |
| DNA diluent | HiMedia | MB228 | |
| Random primers | Thermo Fisher Scientific | 48190011 | |
| dNTP set | Thermo Fisher Scientific | R0181 | |
| Murine RNase inhibitor | NEB | M0314S | |
| Maxima reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | EP0743 | |
| QX200 dd-PCR Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1864033 | |
| Droplet generation oil for Evagreen | Bio-Rad | 1864006 | |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad | 1814040 | |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad | 1864007 | |
| DG8 Cartridge holder | Bio-Rad | 1863051 | |
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864002 | |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad | 12001925 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad | 1814000 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler with 96–Deep Well Reaction Module | Bio-Rad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 1864003 | |
| Quantasoft Software | Bio-Rad | 1864011 | |
| Silica column | Umbrella Life Science | 38220090 | |
| UCSC Genome Browser | https://genome.ucsc.edu/ | ||
| Primer 3 | https://primer3.ut.ee/ |
References
- Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types. PLoS One. 7 (2), 30733 (2012).
- Chen, L. L., Yang, L. Regulation of circRNA biogenesis. RNA Biology. 12 (4), 381-388 (2015).
- Kristensen, L. S., et al. The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nature Reviews Genetics. 20 (11), 675-691 (2019).
- Chen, X., Zhou, M., Yant, L., Huang, C. Circular RNA in disease: Basic properties and biomedical relevance. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. , (2022).
- Sinha, T., Panigrahi, C., Das, D., Chandra Panda, A. Circular RNA translation, a path to hidden proteome. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 13 (1), 1685 (2022).
- Panda, A. C., Xiao, J. Circular RNAs Act as miRNA Sponges. Circular RNAs: Biogenesis and Functions. , 67-79 (2018).
- Das, A., Sinha, T., Shyamal, S., Panda, A. C. Emerging role of circular RNA-protein interactions. Non-Coding RNA. 7 (3), 48 (2021).
- Verduci, L., Tarcitano, E., Strano, S., Yarden, Y., Blandino, G. CircRNAs: Role in human diseases and potential use as biomarkers. Cell Death & Disease. 12 (5), 468 (2021).
- Pandey, P. R., et al. Methods for analysis of circular RNAs. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (1), 1566 (2020).
- Das, A., Das, D., Panda, A. C. Validation of circular RNAs by PCR. PCR Primer Design. Methods in Molecular Biology. 2392, 103-114 (2022).
- Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
- Hayden, R. T., et al. Comparison of droplet digital PCR to real-time PCR for quantitative detection of cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 540-546 (2013).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: From variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7, 2409 (2017).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Ishak, A., AlRawashdeh, M. M., Esagian, S. M., Nikas, I. P. Diagnostic, prognostic, and therapeutic value of droplet digital PCR (ddPCR) in COVID-19 patients: A systematic review. Journal of Clinical Medicine. 10 (23), 5712 (2021).
- Li, H., et al. Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
- Lee, B. T., et al. The UCSC genome browser database: 2022 update. Nucleic Acids Research. 50, 1115-1122 (2022).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Untergasser, A., et al. Primer3–new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research. 40 (15), 115 (2012).
- Das, A., Das, D., Das, A., Panda, A. C. A quick and cost-effective method for DNA-free total RNA isolation using magnetic silica beads. bioRxiv. , (2020).
- Oberacker, P., et al. Simple Synthesis of Functionalized Paramagnetic Beads for Nucleic Acid Purification and Manipulation. Bio-protocol. 9 (20), 3394 (2019).
- Rački, N., Dreo, T., Gutierrez-Aguirre, I., Blejec, A., Ravnikar, M. Reverse transcriptase droplet digital PCR shows high resilience to PCR inhibitors from plant, soil and water samples. Plant Methods. 10 (1), 42 (2014).
- Taylor, S. C., Carbonneau, J., Shelton, D. N., Boivin, G. Optimization of droplet digital PCR from RNA and DNA extracts with direct comparison to RT-qPCR: Clinical implications for quantification of Oseltamivir-resistant subpopulations. Journal of Virological Methods. 224, 58-66 (2015).
