Cuantificación de ARN circulares mediante PCR digital de gotas
Summary
Este protocolo describe el método detallado de PCR digital de gotas (dd-PCR) para la cuantificación precisa de los niveles de ARN circular (circRNA) en células utilizando cebadores divergentes.
Abstract
La reacción en cadena de la polimerasa digital (dd-PCR) es uno de los métodos de cuantificación más sensibles; fracciona la reacción en casi 20,000 gotas de agua en aceite, y la PCR ocurre en las gotas individuales. La dd-PCR tiene varias ventajas sobre la qPCR convencional en tiempo real, incluida una mayor precisión en la detección de objetivos de baja abundancia, la omisión de genes de referencia para la cuantificación, la eliminación de réplicas técnicas para muestras y la demostración de una alta resistencia a los inhibidores en las muestras. Recientemente, la dd-PCR se ha convertido en uno de los métodos más populares para cuantificar con precisión el ADN o ARN objetivo para el análisis y diagnóstico de la expresión génica. Los ARN circulares (circRNAs) son una gran familia de moléculas de ARN cerradas covalentemente recientemente descubiertas que carecen de extremos 5′ y 3′. Se ha demostrado que regulan la expresión génica actuando como esponjas para proteínas de unión a ARN y microARN. Además, los circRNAs se secretan en los fluidos corporales, y su resistencia a las exonucleasas los hace servir como biomarcadores para el diagnóstico de enfermedades. Este artículo tiene como objetivo mostrar cómo realizar el diseño divergente de cebadores, la extracción de ARN, la síntesis de ADNc y el análisis de dd-PCR para cuantificar con precisión los niveles específicos de ARN circular (circRNA) en las células. En conclusión, demostramos la cuantificación precisa de circRNAs utilizando dd-PCR.
Introduction
Los avances recientes en las tecnologías de secuenciación de ARN y los nuevos algoritmos computacionales han descubierto un nuevo miembro de la creciente familia de ARN no codificantes, llamado ARN circular (circRNA)1. Como su nombre indica, los circRNAs son una familia de moléculas de ARN monocatenario sin extremos libres. Están formados por empalme no canónico de cabeza a cola llamado empalme posterior, donde el sitio aceptor de empalme aguas arriba se une covalentemente con el sitio donante de empalme aguas abajo para formar un círculo de ARN estable 1,2. Este proceso podría estar mediado por varios factores, incluyendo elementos repetitivos de Alu invertidos presentes en las aguas arriba y aguas abajo de los exones circularizados, o puede estar mediado por algunos factores de empalme o proteínas de unión a ARN (RBPs)2,3. Los ARN circulares generados exclusivamente a partir de la secuencia exónica o intrónica se clasifican como circARN exónicos y ARN intrónicos circulares o ci-ARN, mientras que algunos circARN exónicos retienen el intrón y se denominan circARN exón-intrón (EIcircRNAs)3,4. Las funciones de los circRNAs son multifacéticas, incluyendo la esponja de miRNA y/o RBP, la regulación de la transcripción y la regulación de la función celular traduciendo en péptidos 3,5,6,7. Varios relatos han destacado la importancia de los circRNAs en diversas enfermedades y procesos fisiológicos8. Además, los patrones de expresión específicos del tejido y la resistencia a la digestión de la exonucleasa lo convierten en un biomarcador funcional para el diagnóstico de enfermedades y también puede ser utilizado como una diana terapéutica adecuada8. Teniendo en cuenta su importancia en la regulación de la salud y las enfermedades, la cuantificación precisa de la expresión de circRNA es la necesidad del momento.
Se han desarrollado varios métodos bioquímicos para cuantificar circRNAs en muestras biológicas9. Uno de los métodos más convenientes y ampliamente aceptados para la cuantificación de circRNA es la transcripción inversa seguida de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (RT-qPCR) utilizando pares de cebadores divergentes10. Sin embargo, la mayoría de los circRNAs están en baja abundancia en comparación con los mRNAs lineales, lo que hace que sea difícil cuantificarlos11. Para superar este problema, buscamos usar PCR digital de gotas (dd-PCR) para cuantificar el número de circRNAs en una muestra dada con precisión. La dd-PCR es una tecnología avanzada de PCR que sigue el principio de microfluídica; genera múltiples gotitas acuosas en aceite, y la PCR ocurre en cada gota como una reacción individual12. La reacción ocurre en gotitas individuales y se analiza utilizando un lector de gotas, que da el número de gotitas positivas o negativas para el gen de interés12. Es la técnica más sensible para cuantificar con precisión un gen de interés, incluso si solo hay una copia única en una muestra determinada. La disminución de la sensibilidad hacia los inhibidores, una mejor precisión y la omisión del gen de referencia para la cuantificación lo hacen más ventajoso que la qPCR convencional13,14,15. Ha sido ampliamente utilizado como herramienta de investigación y diagnóstico para la cuantificación absoluta de un gen de interés16,17. Aquí, describimos el protocolo detallado de dd-PCR para la cuantificación de circRNA en la diferenciación de miotubos C2C12 de ratón y mioblastos C2C12 de ratón proliferantes utilizando cebadores divergentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
La investigación de CircRNA ha crecido en la última década con el descubrimiento de tecnologías de secuenciación de alto rendimiento. Como resultado, se ha considerado una molécula potencial para futuras terapias de ARN. Además, se sabe que actúa como biomarcador en varias enfermedades, incluyendo cáncer y enfermedades cardiovasculares 4,8. Sin embargo, la identificación del circRNA es complicada debido a su baja abundancia y a que solo tiene una secuen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por fondos intramuros del Instituto de Ciencias de la Vida, la beca de investigación DBT (BT / PR27622 / MED / 30/1961 / 2018) y la beca Wellcome Trust / DBT India Alliance [IA / I / 18/2 / 504017] otorgada a Amaresh C. Panda. Agradecemos a otros miembros del laboratorio por corregir el artículo.
Materials
| 1.5 ml microcentifuge tube | Tarson | 500010 | |
| 0.2 ml tube strips with cap | Tarson | 610020, 510073 | |
| Filter Tips | Tarson | 528104 | |
| DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977023 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Cell scrapper | HiMedia | TCP223 | |
| Chloroform | SRL | 96764 | |
| DNA diluent | HiMedia | MB228 | |
| Random primers | Thermo Fisher Scientific | 48190011 | |
| dNTP set | Thermo Fisher Scientific | R0181 | |
| Murine RNase inhibitor | NEB | M0314S | |
| Maxima reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | EP0743 | |
| QX200 dd-PCR Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1864033 | |
| Droplet generation oil for Evagreen | Bio-Rad | 1864006 | |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad | 1814040 | |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad | 1864007 | |
| DG8 Cartridge holder | Bio-Rad | 1863051 | |
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864002 | |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad | 12001925 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad | 1814000 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler with 96–Deep Well Reaction Module | Bio-Rad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 1864003 | |
| Quantasoft Software | Bio-Rad | 1864011 | |
| Silica column | Umbrella Life Science | 38220090 | |
| UCSC Genome Browser | https://genome.ucsc.edu/ | ||
| Primer 3 | https://primer3.ut.ee/ |
References
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