مقايسة السحب إلى جانب التعبير المشترك في خلايا البكتيريا كأداة فعالة من حيث الوقت لاختبار التفاعلات الصعبة بين البروتين والبروتين
Summary
هنا ، نصف طريقة للتعبير البكتيري المشترك للبروتينات الموسومة تفاضليا باستخدام مجموعة من النواقل المتوافقة ، تليها تقنيات السحب التقليدية لدراسة مجمعات البروتين التي لا يمكن أن تتجمع في المختبر.
Abstract
Pulldown هو اختبار تفاعل البروتين والبروتين سهل الاستخدام ويستخدم على نطاق واسع. ومع ذلك ، فإن لها قيودا في دراسة مجمعات البروتين التي لا تتجمع بشكل فعال في المختبر. قد تتطلب هذه المجمعات تجميعا متعديا مشتركا ووجود مرافقين جزيئيين ؛ إما أنها تشكل أوليغومرات مستقرة لا يمكنها الانفصال وإعادة الارتباط في المختبر أو تكون غير مستقرة بدون شريك ملزم. للتغلب على هذه المشاكل ، من الممكن استخدام طريقة تعتمد على التعبير المشترك البكتيري للبروتينات الموسومة بشكل تفاضلي باستخدام مجموعة من النواقل المتوافقة متبوعة بتقنيات السحب التقليدية. يعد سير العمل أكثر كفاءة من حيث الوقت مقارنة بالقائمة المنسدلة التقليدية لأنه يفتقر إلى الخطوات التي تستغرق وقتا طويلا للتنقية المنفصلة للبروتينات المتفاعلة وحضانتها التالية. ميزة أخرى هي قابلية استنساخ أعلى بسبب عدد أقل بكثير من الخطوات وفترة زمنية أقصر تتعرض فيها البروتينات الموجودة في البيئة في المختبر للتحلل البروتيني والأكسدة. تم تطبيق الطريقة بنجاح لدراسة عدد من تفاعلات البروتين والبروتين عندما وجد أن التقنيات الأخرى في المختبر غير مناسبة. يمكن استخدام هذه الطريقة لاختبار تفاعلات البروتين والبروتين على دفعات. تظهر النتائج التمثيلية لدراسات التفاعلات بين مجال BTB والبروتينات المضطربة جوهريا ، و heterodimers من المجالات المرتبطة بإصبع الزنك.
Introduction
يستخدم السحب التقليدي على نطاق واسع لدراسة تفاعلات البروتينوالبروتين 1. ومع ذلك ، غالبا ما لا تتفاعل البروتينات النقية بشكل فعال في المختبر2,3 ، وبعضها غير قابل للذوبان بدون شريكهاالملزم 4,5. قد تتطلب هذه البروتينات تجميعا متعديا مشتركا أو وجود مرافقين جزيئيين5،6،7،8،9. هناك قيد آخر للسحب التقليدي وهو اختبار نشاط التعدد غير المتجانس المحتمل بين المجالات التي يمكن أن توجد كمتجانسات متجانسة مستقرة مجمعة بشكل مشترك8،10 ، حيث لا يمكن للعديد منها الانفصال وإعادة الارتباط في المختبر خلال وقت الحضانة. وجد أن التعبير المشترك مفيد في التغلب على مثل هذه المشاكل 3,11. تم استخدام التعبير المشترك باستخدام النواقل المتوافقة في البكتيريا بنجاح لتنقية المجمعات الجزيئية الكبيرة متعددة الوحدات الفرعية ، بما في ذلك المركب القمعي متعدد المشبك PRC2 12 ، وحدة رأس وسيط RNA polymeraseII 13 ، صفيحة الأساس للبكتيريا T414 ، وحدة deubiquitinylase المعقدة SAGA15،16 ، والفيريتين17. أصول النسخ المتماثل المستخدمة بشكل شائع للتعبير المشترك هي ColE1 و p15A18 و CloDF1319 و RSF20. في نظام التعبير Duet المتاح تجاريا ، يتم دمج هذه الأصول مع جينات مقاومة مختلفة للمضادات الحيوية ومواقع استنساخ متعددة ملائمة لإنتاج ناقلات polycistronic ، مما يسمح بالتعبير عن ما يصل إلى ثمانية بروتينات. هذه الأصول لها أرقام نسخ مختلفة ويمكن استخدامها في مجموعات مختلفة لتحقيق مستويات تعبير متوازنة للبروتينات المستهدفة21. لاختبار تفاعلات البروتين والبروتين ، يتم استخدام علامات تقارب مختلفة ؛ الأكثر شيوعا هي 6xHistidine و glutathione-S-transferase (GST) وبروتين ربط المالتوز (MBP) ، ولكل منها تقارب محدد مع الراتنج المقابل. تعمل GST و MBP أيضا على تعزيز قابلية ذوبان واستقرار البروتينات الموسومة22.
كما تم تطوير عدد من الطرق التي تنطوي على التعبير المشترك للبروتين في الخلايا حقيقية النواة ، وأبرزها مقايسة الخميرة ثنائية الهجين (Y2H) 23. اختبار Y2H رخيص وسهل ويسمح باختبار تفاعلات متعددة ؛ ومع ذلك ، يستغرق سير العمل أكثر من 1 أسبوع لإكماله. هناك أيضا عدد قليل من المقايسات القائمة على خلايا الثدييات الأقل استخداما ، على سبيل المثال ، مقايسة الفلورسنت ثنائية الهجين (F2H) 24 ومقايسة تفاعل البروتين والبروتين في مجموعة الخلايا (CAPPIA) 25. اختبار F2H سريع نسبيا ، مما يسمح بمراقبة تفاعلات البروتين في بيئتها الخلوية الأصلية ، ولكنه يتضمن استخدام معدات تصوير باهظة الثمن. كل هذه الطرق لها ميزة على التعبير بدائية النواة التي توفر الترجمة حقيقية النواة الأصلية وبيئة قابلة للطي. ومع ذلك ، فإنها تكتشف التفاعل بشكل غير مباشر ، إما عن طريق التنشيط النسخي أو عن طريق نقل الطاقة الفلورية ، والتي غالبا ما تنتج القطع الأثرية. أيضا ، قد تحتوي الخلايا حقيقية النواة على شركاء تفاعل آخرين للبروتينات ذات الأهمية ، والتي يمكن أن تتداخل مع اختبار التفاعلات الثنائية بين بروتينات حقيقيات النوى العليا.
تصف الدراسة الحالية طريقة للتعبير المشترك البكتيري للبروتينات الموسومة بشكل تفاضلي تليها تقنيات السحب التقليدية. تسمح هذه الطريقة بدراسة التفاعلات بين البروتينات المستهدفة التي تتطلب التعبير المشترك. إنه أكثر كفاءة من حيث الوقت مقارنة بالسحب التقليدي ، مما يسمح باختبار الدفعات لأهداف متعددة ، مما يجعله مفيدا في معظم الحالات. يعد التعبير المشترك باستخدام المتجهات المتوافقة أكثر ملاءمة من التعبير المشترك متعدد السيسترونيك لأنه لا يتطلب خطوة استنساخ شاقة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تسمح الطريقة الموصوفة باختبار تفاعلات البروتين والبروتين التي لا يمكن تجميعها بكفاءة في المختبر وتتطلب تعبيرا مشتركا. هذه الطريقة هي واحدة من الطرق القليلة المناسبة لدراسة البروتينات غير المتجانسة ، والتي هي أيضا قادرة على homodimerization لأنه ، عند تنقيتها بشكل منفصل ، تشكل هذه البروتين?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل مشاريع مؤسسة العلوم الروسية 19-74-30026 (تطوير الطريقة والتحقق من صحتها) و 19-74-10099 (مقايسات التفاعل بين البروتين والبروتين) ؛ ومن قبل وزارة العلوم والتعليم العالي في الاتحاد الروسي – منحة 075-15-2019-1661 (تحليل تفاعلات البروتين والبروتين التمثيلية).
Materials
| 8-ELEMENT probe | Sonics | 630-0586 | The high throughput 8-element sonicator probes |
| Agar | AppliChem | A0949 | |
| Amylose resin | New England Biolabs | E8021 | Resin for purification of MBP-tagged proteins |
| Antibiotics | AppliChem | A4789 (kanamycin); A0839 (ampicillin) | |
| Beta-mercaptoethanol | AppliChem | A1108 | |
| BL21(DE3) | Novagen | 69450-M | |
| CaCl2 | AppliChem | A4689 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R (Z605212) | |
| Glutathione | AppliChem | A9782 | |
| Glutathione agarose | Pierce | 16100 | Resin for purification of GST-tagged proteins |
| Glycerol | AppliChem | A2926 | |
| HEPES | AppliChem | A3724 | |
| HisPur Ni-NTA Superflow Agarose | Thermo Scientific | 25214 | Resin for purification of 6xHis-tagged proteins |
| Imidazole | AppliChem | A1378 | |
| IPTG | AppliChem | A4773 | |
| KCl | AppliChem | A2939 | |
| LB | AppliChem | 414753 | |
| Maltose | AppliChem | A3891 | |
| MOPS | AppliChem | A2947 | |
| NaCl | AppliChem | A2942 | |
| NP40 | Roche | 11754599001 | |
| pACYCDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71147 | Vector for co-expression of proteins with p15A replication origin |
| pCDFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71340 | Vector for co-expression of proteins with CloDF13 replication origin |
| PMSF | AppliChem | A0999 | |
| Protease Inhibitor Cocktail VII | Calbiochem | 539138 | Protease Inhibitor Cocktail |
| pRSFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71341 | Vector for co-expression of proteins with RSF replication origin |
| SDS | AppliChem | A2263 | |
| Tris | AppliChem | A2264 | |
| VC505 sonicator | Sonics | CV334 | Ultrasonic liquid processor |
| ZnCl2 | AppliChem | A6285 |
References
- Louche, A., Salcedo, S. P., Bigot, S. Protein-protein interactions: Pulldown assays. Methods in Molecular Biology. 1615, 247-255 (2017).
- Rose, R. B., et al. Structural basis of dimerization, coactivator recognition and MODY3 mutations in HNF-1alpha. Nature Structural & Molecular Biology. 7 (9), 744-748 (2000).
- Bonchuk, A., et al. Structural basis of diversity and homodimerization specificity of zinc-finger-associated domains in Drosophila. Nucleic Acids Research. 49 (4), 2375-2389 (2021).
- Nair, S. K., Burley, S. K. X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors. Cell. 112 (2), 193-205 (2003).
- Badonyi, M., Marsh, J. A. Large protein complex interfaces have evolved to promote co-translational assembly. Elife. 11, 79602 (2022).
- Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins. Annual Reviews in Biochemistry. 88, 337-364 (2019).
- Koubek, J., Schmitt, J., Galmozzi, C. V., Kramer, G. Mechanisms of cotranslational protein maturation in bacteria. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 689755 (2021).
- Shiber, A., et al. Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling. Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).
- Shieh, Y. W., et al. Operon structure and co-translational subunit association direct protein assembly in bacteria. Science. 350 (6261), 678-680 (2015).
- Bertolini, M., et al. Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly. Science. 371 (6524), 57-64 (2021).
- Bonchuk, A. N., et al. Structural insights into highly similar spatial organization of zinc-finger associated domains with a very low sequence similarity. Structure. 30 (7), 1004-1015 (2022).
- Justin, N., et al. Structural basis of oncogenic histone H3K27M inhibition of human polycomb repressive complex 2. Nature Communications. 7, 11316 (2016).
- Lariviere, L., et al. Structure of the mediator head module. Nature. 492 (7429), 448-451 (2012).
- Taylor, N. M., et al. Structure of the T4 baseplate and its function in triggering sheath contraction. Nature. 533 (7603), 346-352 (2016).
- Samara, N. L., et al. Structural insights into the assembly and function of the SAGA deubiquitinating module. Science. 328 (5981), 1025-1029 (2010).
- Kohler, A., Zimmerman, E., Schneider, M., Hurt, E., Zheng, N. Structural basis for assembly and activation of the heterotetrameric SAGA histone H2B deubiquitinase module. Cell. 141 (4), 606-617 (2010).
- Rucker, P., Torti, F. M., Torti, S. V. Recombinant ferritin: modulation of subunit stoichiometry in bacterial expression systems. Protein Engineering. 10 (8), 967-973 (1997).
- Selzer, G., Som, T., Itoh, T., Tomizawa, J. The origin of replication of plasmid p15A and comparative studies on the nucleotide sequences around the origin of related plasmids. Cell. 32 (1), 119-129 (1983).
- Nijkamp, H. J., et al. The complete nucleotide sequence of the bacteriocinogenic plasmid CloDF13. Plasmid. 16 (2), 135-160 (1986).
- Som, T., Tomizawa, J. Origin of replication of Escherichia coli plasmid RSF 1030. Molecular General Genetics. 187 (3), 375-383 (1982).
- Tsao, K. L., Waugh, D. S. Balancing the production of two recombinant proteins in Escherichia coli by manipulating plasmid copy number: high-level expression of heterodimeric Ras farnesyltransferase. Protein Expression Purification. 11 (3), 233-240 (1997).
- Nallamsetty, S., Waugh, D. S. Solubility-enhancing proteins MBP and NusA play a passive role in the folding of their fusion partners. Protein Expression Purification. 45 (1), 175-182 (2006).
- Paiano, A., Margiotta, A., De Luca, M., Bucci, C. Yeast two-hybrid assay to identify interacting proteins. Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 70 (2019).
- Zolghadr, K., Rothbauer, U., Leonhardt, H. The fluorescent two-hybrid (F2H) assay for direct analysis of protein-protein interactions in living cells. Methods in Molecular Biology. 812, 275-282 (2012).
- Fiebitz, A., et al. High-throughput mammalian two-hybrid screening for protein-protein interactions using transfected cell arrays. BMC Genomics. 9, 68 (2008).
- Bonchuk, A. N., Georgiev, P. G., Maksimenko, O. G. CTCF and Sgfl1 proteins form alternative complexes with ENY2 proteins. Doklady Biochemistry and Biophysics. 468 (1), 180-182 (2016).
- Maksimenko, O., et al. Two new insulator proteins, Pita and ZIPIC, target CP190 to chromatin. Genome Research. 25 (1), 89-99 (2015).
- Sabirov, M., et al. Mechanism and functional role of the interaction between CP190 and the architectural protein Pita in Drosophila melanogaster. Epigenetics Chromatin. 14 (1), 16 (2021).
- Dong, S., Provart, N. J. Analyses of protein interaction networks using computational tools. Methods in Molecular Biology. 1794, 97-117 (2018).
