까다로운 단백질-단백질 상호작용을 테스트하기 위한 시간 효율적인 도구로서 박테리아 세포의 공동 발현과 결합된 풀다운 분석
Summary
여기에서는 일련의 호환 가능한 벡터를 사용하여 차등적으로 태그된 단백질의 박테리아 공동 발현 방법을 설명한 다음 시험관 내에서 조립할 수 없는 단백질 복합체를 연구하기 위한 기존의 풀다운 기술을 설명합니다.
Abstract
풀다운은 쉽고 널리 사용되는 단백질-단백질 상호작용 분석법입니다. 그러나 시험관 내에서 효과적으로 조립되지 않는 단백질 복합체를 연구하는 데는 한계가 있습니다. 이러한 복합체는 공동 번역 조립 및 분자 샤페론의 존재를 필요로 할 수 있습니다. 이들은 시험관 내에서 해리 및 재결합할 수 없는 안정한 올리고머를 형성하거나 결합 파트너 없이는 불안정합니다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 종래의 풀다운 기술에 이어 일련의 호환 벡터를 사용하여 차등적으로 태깅된 단백질의 박테리아 동시 발현에 기초한 방법을 사용할 수 있다. 워크플로우는 상호 작용하는 단백질의 개별 정제 및 후속 배양에 대한 시간 소모적인 단계가 없기 때문에 기존 풀다운에 비해 시간 효율성이 더 높습니다. 또 다른 장점은 훨씬 더 적은 수의 단계와 시험관 내 환경 내에 존재하는 단백질이 단백질 분해 및 산화에 노출되는 더 짧은 기간으로 인해 더 높은 재현성입니다. 이 방법은 다른 시험관 내 기술이 부적합한 것으로 판명되었을 때 여러 단백질-단백질 상호 작용을 연구하는 데 성공적으로 적용되었습니다. 이 방법은 단백질-단백질 상호작용을 일괄 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 대표적인 결과는 BTB 도메인과 본질적으로 무질서한 단백질 사이의 상호작용 및 징크-핑거 관련 도메인의 이종이량체에 대한 연구에 대해 표시됩니다.
Introduction
기존의 풀다운은 단백질-단백질 상호작용을 연구하는 데 널리 사용된다1. 그러나, 정제된 단백질은 종종 시험관 내에서 효과적으로 상호작용하지 않으며2,3, 이들 중 일부는 그들의 결합 파트너 없이는 불용성이다 4,5. 이러한 단백질은 공동 번역 조립 또는 분자 샤페론 5,6,7,8,9의 존재를 필요로 할 수 있습니다. 종래의 풀다운의 또 다른 한계는 많은 도메인이 배양 시간 동안 시험관 내에서 해리 및 재결합할 수 없기 때문에, 이들 중 다수가 동시번역적으로 조립된 안정한 호모올리고머로서 존재할 수 있는 도메인 간의 가능한 헤테로멀티머화 활성을 시험하는 것이다 8,10. 동시발현은 이러한 문제를 극복하는데 유용한 것으로 밝혀졌다 3,11. 박테리아에서 호환 가능한 벡터를 사용한 공동 발현은 폴리콤 억제 복합체 PRC212, RNA 중합효소 II 중재자 헤드 모듈13, 박테리오파지 T4 베이스플레이트 14, SAGA 복합체 데비퀴티닐라제 모듈 15,16 및 페리틴 17을 포함하는 대형 다중 서브유닛 거대분자 복합체를 정제하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 공동-발현에 통상적으로 사용되는 복제 기원은 ColE1, p15A18, CloDF1319 및 RSF20이다. 상업적으로 이용 가능한 Duet 발현 시스템에서, 이들 기원은 상이한 항생제 내성 유전자 및 편리한 다중 클로닝 부위와 결합되어 폴리시스트로닉 벡터를 생성하여, 최대 8개의 단백질의 발현을 허용한다. 이들 기원은 상이한 복제 수를 가지며, 표적 단백질의 균형 잡힌 발현 수준을 달성하기 위해 다양한 조합으로 사용될 수 있다21. 단백질-단백질 상호작용을 테스트하기 위해 다양한 친화성 태그가 사용됩니다. 가장 흔한 것은 6x히스티딘, 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST) 및 맥아당 결합 단백질(MBP)이며, 각각은 해당 수지에 특이적인 친화력을 가지고 있습니다. GST와 MBP는 또한 태그가 부착된 단백질의 용해도와 안정성을 향상시킨다22.
진핵 세포에서 단백질 공동 발현과 관련된 여러 방법도 개발되었으며, 그 중 가장 두드러진 것은 효모 2-하이브리드 분석(Y2H)23입니다. Y2H 분석은 저렴하고 쉬우며 여러 상호 작용을 테스트할 수 있습니다. 그러나 워크플로를 완료하는 데 1주일 이상 걸립니다. 또한 형광 2-하이브리드 분석(F2H)24 및 세포 어레이 단백질-단백질 상호작용 분석(CAPPIA)25과 같이 덜 자주 사용되는 포유류 세포 기반 분석법도 있습니다. F2H 분석은 비교적 빠르기 때문에 본래의 세포 환경에서 단백질 상호작용을 관찰할 수 있지만 고가의 이미징 장비를 사용해야 합니다. 이들 모든 방법은 천연 진핵생물 번역 및 접힘 환경을 제공하는 원핵생물 발현에 비해 이점을 갖는다; 그러나 그들은 전사 활성화 또는 형광 에너지 전달에 의해 간접적으로 상호 작용을 감지하며, 이는 종종 인공물을 생성합니다. 또한, 진핵 세포는 관심 단백질의 다른 상호작용 파트너를 포함할 수 있으며, 이는 고등 진핵생물의 단백질 간의 이진 상호작용 테스트를 방해할 수 있습니다.
본 연구는 기존의 풀다운 기술에 이어 차등적으로 태그된 단백질의 박테리아 공동 발현 방법을 설명합니다. 이 방법을 사용하면 공동 발현이 필요한 표적 단백질 간의 상호 작용을 연구 할 수 있습니다. 기존 풀다운에 비해 시간 효율성이 높아 여러 대상의 배치 테스트가 가능하므로 대부분의 경우 유리합니다. 호환 가능한 벡터를 사용한 공동-발현은 힘든 클로닝 단계를 필요로 하지 않기 때문에 폴리시스트로닉 공동-발현보다 더 편리하다.
Protocol
Representative Results
Discussion
설명된 방법을 사용하면 시험관 내에서 효율적으로 조립할 수 없고 공동 발현이 필요한 단백질-단백질 상호 작용을 테스트할 수 있습니다. 이 방법은 헤테로다이머화 단백질을 연구하는 데 적합한 몇 안 되는 접근법 중 하나이며, 이러한 단백질은 별도로 정제될 때 실험 동안 가장 자주 해리 및 재결합할 수 없는 안정적인 동종이량체를 형성하기 때문에 동종이량체화도 가능합니다<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 러시아 과학 재단 프로젝트 19-74-30026 (방법 개발 및 검증) 및 19-74-10099 (단백질-단백질 상호 작용 분석)의 지원을 받았습니다. 러시아 연방 과학 고등 교육부 보조금 075-15-2019-1661 (대표적인 단백질-단백질 상호 작용 분석).
Materials
| 8-ELEMENT probe | Sonics | 630-0586 | The high throughput 8-element sonicator probes |
| Agar | AppliChem | A0949 | |
| Amylose resin | New England Biolabs | E8021 | Resin for purification of MBP-tagged proteins |
| Antibiotics | AppliChem | A4789 (kanamycin); A0839 (ampicillin) | |
| Beta-mercaptoethanol | AppliChem | A1108 | |
| BL21(DE3) | Novagen | 69450-M | |
| CaCl2 | AppliChem | A4689 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R (Z605212) | |
| Glutathione | AppliChem | A9782 | |
| Glutathione agarose | Pierce | 16100 | Resin for purification of GST-tagged proteins |
| Glycerol | AppliChem | A2926 | |
| HEPES | AppliChem | A3724 | |
| HisPur Ni-NTA Superflow Agarose | Thermo Scientific | 25214 | Resin for purification of 6xHis-tagged proteins |
| Imidazole | AppliChem | A1378 | |
| IPTG | AppliChem | A4773 | |
| KCl | AppliChem | A2939 | |
| LB | AppliChem | 414753 | |
| Maltose | AppliChem | A3891 | |
| MOPS | AppliChem | A2947 | |
| NaCl | AppliChem | A2942 | |
| NP40 | Roche | 11754599001 | |
| pACYCDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71147 | Vector for co-expression of proteins with p15A replication origin |
| pCDFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71340 | Vector for co-expression of proteins with CloDF13 replication origin |
| PMSF | AppliChem | A0999 | |
| Protease Inhibitor Cocktail VII | Calbiochem | 539138 | Protease Inhibitor Cocktail |
| pRSFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71341 | Vector for co-expression of proteins with RSF replication origin |
| SDS | AppliChem | A2263 | |
| Tris | AppliChem | A2264 | |
| VC505 sonicator | Sonics | CV334 | Ultrasonic liquid processor |
| ZnCl2 | AppliChem | A6285 |
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