Etablierung von 3-dimensionalen Sphäroiden aus patienteneigenen Tumorproben und Bewertung ihrer Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt die Erzeugung von 3D-Tumorkulturmodellen aus primären Krebszellen und die Bewertung ihrer Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten unter Verwendung von Zellviabilitätsassays und mikroskopischen Untersuchungen.
Abstract
Trotz bemerkenswerter Fortschritte im Verständnis der Tumorbiologie scheitert die überwiegende Mehrheit der onkologischen Arzneimittelkandidaten, die in klinische Studien eintreten, oft aufgrund mangelnder klinischer Wirksamkeit. Diese hohe Ausfallrate verdeutlicht die Unfähigkeit der aktuellen präklinischen Modelle, die klinische Wirksamkeit vorherzusagen, hauptsächlich aufgrund ihrer Unzulänglichkeit bei der Reflexion der Tumorheterogenität und der Tumormikroumgebung. Diese Einschränkungen können mit 3-dimensionalen (3D) Kulturmodellen (Sphäroiden) behoben werden, die aus menschlichen Tumorproben von einzelnen Patienten erstellt wurden. Diese 3D-Kulturen repräsentieren die reale Biologie besser als etablierte Zelllinien, die keine Tumorheterogenität widerspiegeln. Darüber hinaus sind 3D-Kulturen besser als 2-dimensionale (2D) Kulturmodelle (Monolayer-Strukturen), da sie Elemente der Tumorumgebung wie Hypoxie, Nekrose und Zelladhäsion nachbilden und die natürliche Zellform und das Wachstum erhalten. In der vorliegenden Studie wurde eine Methode zur Herstellung von Primärkulturen von Krebszellen von einzelnen Patienten entwickelt, die 3D sind und in mehrzelligen Sphäroiden wachsen. Die Zellen können direkt aus Patiententumoren oder von Patienten stammenden Xenotransplantaten gewonnen werden. Die Methode ist bei soliden Tumoren (z. B. Dickdarm, Brust und Lunge) weit verbreitet und auch kostengünstig, da sie in ihrer Gesamtheit in einem typischen Labor für Krebsforschung/Zellbiologie durchgeführt werden kann, ohne auf spezielle Geräte angewiesen zu sein. Hier wird ein Protokoll zur Generierung von 3D-Tumorkulturmodellen (multizelluläre Sphäroide) aus primären Krebszellen und zur Bewertung ihrer Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten mit zwei komplementären Ansätzen vorgestellt: einem Zellviabilitätstest (MTT) und mikroskopischen Untersuchungen. Diese multizellulären Sphäroide können verwendet werden, um potenzielle Wirkstoffkandidaten zu bewerten, potenzielle Biomarker oder therapeutische Ziele zu identifizieren und die Mechanismen des Ansprechens und der Resistenz zu untersuchen.
Introduction
In-vitro- und In-vivo-Studien stellen komplementäre Ansätze für die Entwicklung von Krebstherapien dar. In-vitro-Modelle ermöglichen die Kontrolle der meisten experimentellen Variablen und erleichtern quantitative Analysen. Sie dienen oft als kostengünstige Screening-Plattformen und können auch für mechanistische Studien verwendet werden1. Ihre biologische Relevanz ist jedoch von Natur aus begrenzt, da solche Modelle die Mikroumgebung des Tumors nur teilweise widerspiegeln1. Im Gegensatz dazu erfassen In-vivo-Modelle, wie z. B. patientenabgeleitete Xenotransplantate (PDX), die Komplexität der Tumormikroumgebung und eignen sich besser für translationale Studien und die Individualisierung der Behandlung von Patienten (d. h. die Untersuchung des Ansprechens auf Medikamente in einem Modell, das von einem einzelnen Patienten abgeleitet wurde)1. In-vivo-Modelle sind jedoch nicht förderlich für Hochdurchsatz-Ansätze für das Wirkstoff-Screening, da die experimentellen Parameter nicht so streng kontrolliert werden können wie In-vitro-Modelle und weil ihre Entwicklung zeitaufwändig, arbeitsintensiv und kostspielig ist 1,2.
In-vitro-Modelle sind seit über 100 Jahren verfügbar, und Zelllinien sind seit über 70 Jahren verfügbar3. In den letzten Jahrzehnten hat die Komplexität der verfügbaren In-vitro-Modelle solider Tumoren jedoch dramatisch zugenommen. Diese Komplexität reicht von 2-dimensionalen (2D) Kulturmodellen (Monolayer-Strukturen), bei denen es sich entweder um etablierte Tumorzelllinien oder um primäre Zelllinien handelt, bis hin zu neueren Ansätzen mit 3-dimensionalen (3D) Modellen1. Innerhalb der 2D-Modelle besteht eine wesentliche Unterscheidung zwischen der etablierten und der primären Zelllinie4. Etablierte Zelllinien werden immortalisiert; Daher kann dieselbe Zelllinie über viele Jahre hinweg global verwendet werden, was aus historischer Sicht die Zusammenarbeit, die Anhäufung von Daten und die Entwicklung vieler Behandlungsstrategien erleichtert. Genetische Aberrationen in diesen Zelllinien häufen sich jedoch mit jeder Passage an und beeinträchtigen so ihre biologische Relevanz. Darüber hinaus spiegelt die begrenzte Anzahl verfügbarer Zelllinien nicht die Heterogenität der Tumoren bei Patientenwider 4,5. Primäre Krebszelllinien werden direkt aus resezierten Tumorproben gewonnen, die durch Biopsien, Pleuraergüsse oder Resektionen gewonnen wurden. Daher sind primäre Krebszelllinien biologisch relevanter, da sie Elemente der Tumormikroumgebung und Tumoreigenschaften bewahren, wie z. B. interzelluläres Verhalten (z. B. Cross-Talk zwischen gesunden und krebsartigen Zellen) und die stammähnlichen Phänotypen von Krebszellen. Die Replikationskapazität der primären Zelllinien ist jedoch begrenzt, was zu einer engen Kulturzeit führt und die Anzahl der Tumorzellen begrenzt, die für Analysen verwendet werden können 4,5.
Modelle, die 3D-Kulturen verwenden, sind biologisch relevanter als 2D-Kulturmodelle, da die In-vivo-Bedingungen beibehalten werden. So bewahren 3D-Kulturmodelle die natürliche Zellform und das Zellwachstum und replizieren Elemente der Tumorumgebung wie Hypoxie, Nekrose und Zelladhäsion. Zu den am häufigsten verwendeten 3D-Modellen in der Krebsforschung gehören mehrzellige Sphäroide, gerüstbasierte Strukturen und matrixeingebettete Kulturen 4,6,7.
Das vorliegende Protokoll generiert 3D-Tumorkulturmodelle (multizelluläre Sphäroide) aus primären Krebszellen und bewertet deren Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten mit zwei komplementären Ansätzen: einem Zellviabilitätstest (MTT) und mikroskopischen Untersuchungen. Die hier vorgestellten repräsentativen Ergebnisse stammen von Brust- und Darmkrebs; Dieses Protokoll ist jedoch auf andere solide Tumorarten (z. B. Cholangiokarzinom, Magen-, Lungen- und Bauchspeicheldrüsenkrebs) anwendbar und auch kostengünstig, da es in seiner Gesamtheit in einem typischen Krebsforschungs-/Zellbiologielabor durchgeführt werden kann, ohne auf spezielle Geräte angewiesen zu sein. Die mit diesem Ansatz erzeugten multizellulären Sphäroide können verwendet werden, um potenzielle Wirkstoffkandidaten zu bewerten, potenzielle Biomarker oder therapeutische Ziele zu identifizieren und die Mechanismen des Ansprechens und der Resistenz zu untersuchen.
Dieses Protokoll gliedert sich in drei Abschnitte: (1) die Erzeugung, Sammlung und Zählung der Sphäroide in Vorbereitung auf ihre Verwendung als Modell für die Prüfung der Wirksamkeit von Arzneimitteln; (2) MTT-Assay zur Beurteilung der Arzneimittelwirksamkeit auf die Sphäroide; und (3) die mikroskopische Bewertung morphologischer Veränderungen nach der Behandlung der Sphäroide mit Medikamenten als weiterer Ansatz zur Bewertung der Wirksamkeit von Medikamenten (Abbildung 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Das vorliegende Protokoll beschreibt ein einfaches Verfahren zur Erzeugung von 3D-Primärzellkulturen (Sphäroiden), die aus menschlichen Tumorproben gewonnen werden. Diese Sphäroide können für verschiedene Analysen verwendet werden, einschließlich der Bewertung potenzieller Wirkstoffkandidaten und Wirkstoffkombinationen, der Identifizierung potenzieller Biomarker oder therapeutischer Ziele und der Untersuchung der Mechanismen des Ansprechens und der Resistenz. Das Protokoll verwendet entweder Primärtumorzellen, die…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nichts.
Materials
| 5 Fluorouracil | TEVA Israel | lot 16c22NA | Fluorouracil, Adrucil |
| Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutase Cell Dissociation |
| Cisplatin | TEVA Israel | 20B06LA | Abiplatin, |
| Cultrex | Trevigen | 3632-010-02 | Basement membrane matrix, type 3 |
| DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D2650-100ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2391595 | |
| Flurometer ELISA reader | Biotek | Synergy H1 | Gen5 3.11 |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma Aldrich | 320331 | for stop solution |
| ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | Version 1.52a | Open-source software ImageJ |
| Isopropanol | Gadot | P180008215 | for stop solution |
| L-glutamine | Gibco | 1843977 | |
| MTT | Sigma Aldrich | M5655-1G | 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| Palbociclib | Med Chem Express | CAS # 571190-30-2 | |
| PBS | Gibco | 14190094 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Without Calcium and Magnesium |
| Penicillin–streptomycin | Invitrogen | 2119399 | |
| Phenol-free RPMI 1640 | Biological industries, Israel | 01-103-1A | |
| Pippeting reservoir | Alexred | RED LTT012025 | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco | 11530586 | |
| Sunitinib | Med Chem Express | CAS # 341031-54-7 | |
| Trastuzumab | F. Hoffmann – La Roche Ltd, Basel, Switherland | 10172154 IL | Herceptin |
| Trypan blue 0.5% solution | Biological industries, Israel | 03-102-1B | |
| Ultra-low attachment 96 well plate | Greiner Bio-one | 650970 | |
| Vinorelbine | Ebewe | 11733027-03 | Navelbine |
References
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