Estabelecendo esferoides tridimensionais de amostras tumorais derivadas de pacientes e avaliando sua sensibilidade a drogas
Summary
O presente protocolo descreve a geração de modelos de cultura tumoral 3D a partir de células cancerosas primárias e a avaliação de sua sensibilidade a drogas por meio de ensaios de viabilidade celular e exames microscópicos.
Abstract
Apesar dos notáveis avanços na compreensão da biologia tumoral, a grande maioria dos candidatos a medicamentos oncológicos que entram em ensaios clínicos falham, muitas vezes devido à falta de eficácia clínica. Essa alta taxa de falha ilumina a incapacidade dos modelos pré-clínicos atuais em predizer a eficácia clínica, principalmente devido à sua inadequação em refletir a heterogeneidade tumoral e o microambiente tumoral. Essas limitações podem ser abordadas com modelos de cultura tridimensionais (3D) (esferoides) estabelecidos a partir de amostras tumorais humanas derivadas de pacientes individuais. Essas culturas 3D representam melhor a biologia do mundo real do que linhagens celulares estabelecidas que não refletem a heterogeneidade tumoral. Além disso, as culturas 3D são melhores do que os modelos de cultura 2D (estruturas monocamadas), pois replicam elementos do ambiente tumoral, como hipóxia, necrose e adesão celular, e preservam a forma e o crescimento natural da célula. No presente estudo, um método foi desenvolvido para preparar culturas primárias de células cancerosas de pacientes individuais que são 3D e crescem em esferoides multicelulares. As células podem ser derivadas diretamente de tumores de pacientes ou xenoenxertos derivados de pacientes. O método é amplamente aplicável a tumores sólidos (por exemplo, cólon, mama e pulmão) e também é custo-efetivo, pois pode ser realizado em sua totalidade em um laboratório típico de pesquisa de câncer/biologia celular sem depender de equipamentos especializados. Neste trabalho, é apresentado um protocolo para gerar modelos 3D de cultura tumoral (esferoides multicelulares) a partir de células cancerosas primárias e avaliar sua sensibilidade a drogas usando duas abordagens complementares: um ensaio de viabilidade celular (MTT) e exames microscópicos. Esses esferoides multicelulares podem ser usados para avaliar potenciais candidatos a fármacos, identificar potenciais biomarcadores ou alvos terapêuticos e investigar os mecanismos de resposta e resistência.
Introduction
Estudos in vitro e in vivo representam abordagens complementares para o desenvolvimento de tratamentos oncológicos. Os modelos in vitro permitem o controle da maioria das variáveis experimentais e facilitam as análises quantitativas. Muitas vezes servem como plataformas de triagem de baixo custo e também podem ser usadas para estudos mecanísticos1. No entanto, sua relevância biológica é inerentemente limitada, uma vez que tais modelos refletem apenas parcialmente o microambientetumoral1. Em contraste, modelos in vivo, como os xenoenxertos derivados do paciente (PDX), capturam a complexidade do microambiente tumoral e são mais adequados para estudos translacionais e tratamento individualizado em pacientes (ou seja, investigando a resposta a drogas em um modelo derivado de um paciente individual)1. No entanto, os modelos in vivo não são propícios a abordagens de alto rendimento para triagem de drogas, uma vez que os parâmetros experimentais não podem ser controlados tão rigorosamente quanto nos modelos in vitro e porque seu desenvolvimento é demorado, trabalhoso e dispendioso 1,2.
Modelos in vitro estão disponíveis há mais de 100 anos e linhagens celulares estão disponíveis há mais de 70 anos3. Durante as últimas décadas, no entanto, a complexidade dos modelos disponíveis in vitro de tumores sólidos aumentou dramaticamente. Essa complexidade varia desde modelos de cultura 2-dimensional (2D) (estruturas monocamadas) que são linhagens celulares estabelecidas derivadas de tumores ou linhagens celulares primárias até abordagens mais recentes envolvendo modelos 3-dimensionais (3D)1. Dentro dos modelos 2D, uma distinção fundamental é entre as linhagens celulares estabelecidas e primárias4. Linhagens celulares estabelecidas são imortalizadas; Portanto, a mesma linhagem celular pode ser usada globalmente ao longo de muitos anos, o que, de uma perspectiva histórica, facilita a colaboração, o acúmulo de dados e o desenvolvimento de muitas estratégias de tratamento. No entanto, aberrações genéticas nessas linhagens celulares se acumulam a cada passagem, comprometendo sua relevância biológica. Além disso, o número limitado de linhagens celulares disponíveis não reflete a heterogeneidade dos tumores nospacientes4,5. As linhagens celulares primárias de câncer são derivadas diretamente de amostras tumorais ressecadas obtidas por biópsias, derrames pleurais ou ressecções. Portanto, as linhagens primárias de células cancerosas são biologicamente mais relevantes, pois preservam elementos do microambiente tumoral e características tumorais, como comportamentos intercelulares (por exemplo, cross-talk entre células saudáveis e cancerosas) e fenótipos semelhantes a troncos de células cancerosas. No entanto, a capacidade replicativa das linhagens celulares primárias é limitada, o que leva a um tempo de cultivo estreito e limita o número de células tumorais que podem ser utilizadas paraanálises4,5.
Modelos usando culturas 3D são biologicamente mais relevantes do que modelos de cultura 2D, uma vez que as condições in vivo são mantidas. Assim, modelos de cultura 3D preservam a forma e o crescimento natural das células e replicam elementos do ambiente tumoral, como hipóxia, necrose e adesão celular. Os modelos 3D mais comumente usados na pesquisa do câncer incluem esferoides multicelulares, estruturas baseadas em arcabouços e culturas embutidas emmatriz4,6,7.
O presente protocolo gera modelos de cultura tumoral 3D (esferoides multicelulares) a partir de células cancerosas primárias e avalia sua sensibilidade a drogas usando duas abordagens complementares: um ensaio de viabilidade celular (MTT) e exames microscópicos. Os resultados representativos aqui apresentados são de câncer de mama e cólon; No entanto, esse protocolo é amplamente aplicável a outros tipos de tumores sólidos (por exemplo, colangiocarcinoma, câncer gástrico, pulmonar e pancreático) e também é custo-efetivo, pois pode ser realizado em sua totalidade em um laboratório típico de pesquisa em câncer/biologia celular sem depender de equipamentos especializados. Os esferoides multicelulares gerados por essa abordagem podem ser usados para avaliar potenciais candidatos a fármacos, identificar potenciais biomarcadores ou alvos terapêuticos e investigar os mecanismos de resposta e resistência.
Esse protocolo é dividido em três seções: (1) geração, coleta e contagem dos esferoides em preparação para seu uso como modelo para testar a eficácia de fármacos; (2) ensaio de MTT para avaliar a eficácia da droga sobre os esferoides; e (3) a avaliação microscópica das alterações morfológicas após o tratamento dos esferoides com drogas como outra abordagem para avaliar a eficácia das drogas (Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
O presente protocolo descreve um método simples para gerar culturas de células primárias 3D (esferoides) derivadas de amostras tumorais humanas. Esses esferoides podem ser usados para várias análises, incluindo a avaliação de potenciais candidatos a fármacos e combinações de fármacos, a identificação de potenciais biomarcadores ou alvos terapêuticos e a investigação dos mecanismos de resposta e resistência. O protocolo utiliza células tumorais primárias derivadas diretamente de amostras de pacientes ou…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nenhum.
Materials
| 5 Fluorouracil | TEVA Israel | lot 16c22NA | Fluorouracil, Adrucil |
| Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutase Cell Dissociation |
| Cisplatin | TEVA Israel | 20B06LA | Abiplatin, |
| Cultrex | Trevigen | 3632-010-02 | Basement membrane matrix, type 3 |
| DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D2650-100ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2391595 | |
| Flurometer ELISA reader | Biotek | Synergy H1 | Gen5 3.11 |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma Aldrich | 320331 | for stop solution |
| ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | Version 1.52a | Open-source software ImageJ |
| Isopropanol | Gadot | P180008215 | for stop solution |
| L-glutamine | Gibco | 1843977 | |
| MTT | Sigma Aldrich | M5655-1G | 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| Palbociclib | Med Chem Express | CAS # 571190-30-2 | |
| PBS | Gibco | 14190094 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Without Calcium and Magnesium |
| Penicillin–streptomycin | Invitrogen | 2119399 | |
| Phenol-free RPMI 1640 | Biological industries, Israel | 01-103-1A | |
| Pippeting reservoir | Alexred | RED LTT012025 | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco | 11530586 | |
| Sunitinib | Med Chem Express | CAS # 341031-54-7 | |
| Trastuzumab | F. Hoffmann – La Roche Ltd, Basel, Switherland | 10172154 IL | Herceptin |
| Trypan blue 0.5% solution | Biological industries, Israel | 03-102-1B | |
| Ultra-low attachment 96 well plate | Greiner Bio-one | 650970 | |
| Vinorelbine | Ebewe | 11733027-03 | Navelbine |
References
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