本文介绍一种利用基于电子学的微流控平台——机械节点孔传感（mechano-NPS）技术，对单个细胞进行机械表型分析的方法。该平台在测量细胞弹性与黏性等生物物理特性的同时，可保持每秒1至10个细胞的中等通量。
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方法文章
机械-节点-孔传感：一种用于多参数单细胞黏弹性测量的快速无标记平台
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
细胞的力学特性参与了多种生物过程和疾病，从干细胞分化到癌症转移均涉及其中。传统的细胞力学特性测量方法，如原子力显微镜（AFM）和微吸管抽吸法（MA），能够获取丰富的信息，反映细胞完整的黏弹性响应；然而，这些方法通量极低，存在明显局限性。高通量方法如实时变形性流式技术（RT-DC）仅能获取有限的力学信息，通常局限于单一参数读数，仅反映细胞的弹性特性。相比之下，力学节点孔传感技术（mechano-NPS）是一种灵活、无需标记的微流控平台，能够在中等通量条件下实现对细胞多参数黏弹性特性的测量，填补了上述方法之间的空白。该技术采用直流（DC）测量法，在细胞通过微流控通道时对其进行监测，记录细胞在通过狭窄收缩区域之前、期间和之后的尺寸与速度。这些信息（即尺寸和速度）被用于量化每个细胞的横向变形程度、抗变形能力以及变形后的恢复能力。总体而言，这种基于电子学的微流控平台可提供多种细胞黏弹性参数，从而更全面地揭示细胞的力学状态。由于该方法对样本前处理要求极低，采用简单的电子测量手段（而非高速相机），并利用标准的软光刻技术进行器件制备，因此该平台的实施简便、易于获取，且可灵活适配下游分析。该平台所具备的灵活性、实用性与高灵敏度，已为多种不同类型细胞提供了独特的力学信息，未来在基础科学研究与临床诊断中具有广泛的应用潜力。
引言
单个细胞是具有动态特性的黏弹性材料1。多种内部和外部过程（例如有丝分裂的启动或细胞外基质[ECM]的重塑）会影响细胞的结构和组成2,3,4，常常导致产生与其当前状态相适应的独特生物物理特性。特别是，机械特性已被证明是细胞发育、生理状态和病理状态的重要生物标志物，能够提供有价值的定量信息，从而补充传统的分子和遗传学研究方法5,6,7。例如，Li 等人最近描述了耐药性与药物敏感性急性早幼粒细胞白血病细胞之间的力学差异，同时利用RNA-seq技术发现了差异表达的细胞骨架相关基因8。通过理解单细胞力学与细胞功能之间复杂的相互作用，机械表型分析在基础科学研究和临床诊断的革新中具有广泛的应用前景9。
目前测量单细胞力学性质最广泛采用的工具是原子力显微镜（AFM）。尽管AFM能够实现高分辨率、局部化的细胞力学特性测量，但其通量仍受限于<0.01 个细胞/秒
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方案
1. 设计装置几何结构
- 选择尺寸测量和回收区段的宽度时，应使其宽于待测最大细胞的直径，同时保持足够的信噪比（SNR）。参见 补充表 2 有关不同细胞系的尺寸和回收片段宽度的示例。
- 选择收缩段宽度，以对将进行力学表型分析的细胞的平均尺寸施加30%–40%的应变。应变定义为
，其中 d 是细胞直径和 wc 收缩通道宽度2,8。参见 补充表 2 针对不同细胞系的各种收缩段宽度。
注意：如果希望比较直径差异显著的细胞类型或条件，应使用不同的装置设计，并针对每种细胞类型/条件采用特定的收缩段宽度。 - 为每种独特的设备几何结构设计一个参考装置。这是确定 De微流控通道中定径孔段的有效直径。
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结果
本文介绍的力学表型分析平台是一种简单且多功能的方法，可用于中等通量地测量单个细胞的生物物理特性。细胞在恒定压力驱动下流经微流控通道（图1A）。当细胞通过时，利用数据采集硬件记录微流控通道的长度以及产生的电流脉冲信号。所采集的信号（图1B、C）随后通过基于MATLAB开发的定制软件进行处理，以提取相关的单细胞力学特性。图1D展示了该实验方案的图形化概述。
制备器件时，首先制备负极主模具，并用于浇铸PDMS（图2）。成功的主模具如补充图3所示，其微流控通道具有光滑、垂直的侧壁，且无任何缺陷（图4Ai）。在制备初始主模具时应格外小心，因为在制备不良的晶圆（补充图3）中，任何缺陷都会传递到后续所.......
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讨论
使用这种机械表型分析技术测量单个细胞的机械特性包括三个阶段：器件制备、数据采集和数据分析。在每个阶段中，都有一些关键因素可能显著影响实验结果。在器件制备过程中，通道几何结构的一致性以及器件之间的均匀性对于获得准确且可重复的结果至关重要。具体而言，每个器件的侧壁应相对光滑（图4Ai），且在重复制备的器件中通道高度应相近。任何存在部分阻碍细胞流动缺陷的器件，尤其是收缩通道中的缺陷（图4Aii），均应予以弃用。使用通道几何结构中存在明显缺陷的器件将导致不准确且不可重复的结果。在数据采集过程中，用户必须能够识别数据收集期间通道中是否发生堵塞。一个示例脚本"NPS.m"（可在 https://github.com/sohnlab/node-pore-sensing-public 获取）可显示实时电流测量值，使用户能够实时监测通道状态和细胞通过事件。堵塞特征性的脉冲信号如 图4B所示。特别需要注意的是收缩通道中仍允许部分细胞通过的堵塞情况，因为细.......
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披露
L. L. S 持有美国专利第 11,383,241 号：“机械节点孔传感”（Mechano-node-pore sensing），发明人为 J. Kim、S. Han 和 L. L. Sohn，授权日期为 2022 年 7 月 12 日。
致谢
本研究获得了美国国家生物医学成像与生物工程研究所（NIBIB 1R01EB024989-01）和美国国家癌症研究所（NCI 1R01CA190843-01）资助项目的支持。A. L. 和 R. R. 获得了H2H8协会研究生研究奖学金的支持。K. L. C. 获得了美国国家科学基金会研究生研究奖学金和Siebel学者奖学金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 丙酮 | J.T. Baker | 5356-05 | 纯度（气相色谱） ≥ 99.5%（https://us.vwr.com/store/product/6057739/acetone-99-5-vlsi-j-t-baker） |
| 铝箔 | n/a | n/a | |
| 模拟低通滤波器 | ThorLabs | EF504 | ≤240 kHz 通带，同轴 BNC 穿通接头 (https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=EF504#ad-image-0) |
| 活检穿孔器 | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | 1毫米，一次性，带活塞（https://mms.mckesson.com/product/573313/Miltex-33-31AA-P25） |
| 刀片 | n/a | n/a | |
| BNC 电缆 | 波莫纳电子 | 2249-C-12 | https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/2249-C-12/603323?utm_adgroup=射频同轴电缆&utm_source=google&utm_ medium=cpc&utm_campaign= 购物产品_线缆组件_NEW&utm_term= &utm_content=同轴电缆（射频）&gclid=Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO2sErQqnVJ 请提供需要翻译的源文本内容。当前提供的源文本为无效字符（pj5OXVObuTI8ZUf1ZeIn7zvzGnx），无法进行翻译。请确认并重新提交正确的英文源文本。 mCWdePrG6SdEJMF3X6ubUaAs w-EALw_wcB |
| 洁净室用聚酯棉签 | Thermo Fisher Scientific | 18383 | https://www.fishersci.com/shop/products/texwipe-cleantip-alpha-polyester-series-swabs-6/18383 |
| 电流前置放大器 | DL Instruments | 1211 | https://www.brltest.com/index.php?main_page=product_info&和产品_ id=1419 |
| 定制PCB（含组件） | n/a | n/a | 参见补充文件4和5 |
| 数据采集终端模块 | 国家仪器公司 | BNC-2120 | https://www.ni.com/en-in/support/model.bnc-2120.html |
| DAQ 至 BNC-2110 电缆 | 国家仪器 | SHC68-68-EPM | https://www.ni.com/en-in/support/model.shc68-68-epm.html |
| 数据采集板（DAQ） | 国家仪器 | PCI-6251 | https://www.ni.com/docs/zh-CN/bundle/pci-6251-feature/page/overview.html |
| 干燥器 | 赛默飞世尔科技 | 5311-0250 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/5311-0250 |
| BNC母头转香蕉插头适配器 | Pomona Electronics | 72909 | https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/72909/1196318 |
| 胎牛血清（FBS） | VWR | 89510-186 | https://us.vwr.com/store/product/18706419/avantor-seradigm-select-grade-usda-approved-origin-fetal-bovine-serum-fbs |
| 玻璃切割器 | Chemglass | CG-1179-21 | https://chemglass.com/plate-glass-cutters-diamond-tips |
| 金蚀刻剂 TFA | Transene | NC0977944 | https://www.fishersci.com/shop/products/NC0977944/NC0977944 |
| 热板 | Thermo Fisher Scientific | SP131825 | |
| 异丙醇 | Spectrum Chemical | I1056-4LTPL | 纯度（气相色谱） ≥99.5%（https://www.spectrumchemical.com/isopropyl-alcohol-99-percent-fcc-i1056） |
| 金属硬件外壳 | 哈蒙德制造 | EJ12126 | https://www.digikey.com/en/products/detail/hammond-manufacturing/EJ12126/2423415 |
| 甲醇 | Sigma-Aldrich | 34860 | 纯度（气相色谱） ≥99.8%（https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/substance/methanol320467561） |
| MF-321显影液 | 凯亚库先进材料 | n/a | https://kayakuam.com/products/mf-321/ |
| MICROPOSIT S1813 正性光刻胶 | 杜邦 | n/a | https://kayakuam.com/products/microposit-s1800-g2-series-photoresists/ |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | 赛默飞世尔科技 | 10010049 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010049?SID=srch-hj-10010049 |
| 光掩模 | 细线成像 | n/a | 光刻掩模根据我们的 CAD 设计定制订购（https://www.fineline-imaging.com/） |
| 普通玻璃显微镜载玻片 | Fisher Scientific | 12-553-5B | 材料：钠钙玻璃，直径75毫米 × 宽50毫米，厚度：0.90毫米–1.10 mm |
| 等离子清洗机 | Harrick Plasma | PDC-001 | https://harrickplasma.com/plasma-cleaners/expanded-plasma-cleaner/ |
| 塑料培养皿 | 赛默飞世尔科技 | FB0875712 | 100 mm（https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-raised-ridge-100-x-15mm/FB0875712） |
| 压力控制器 | Fluigent | MFCS-EZ | https://www.fluigent.com/research/instruments/pressure-flow-controllers/mfcs-series/ |
| 压力控制器软件 | Fluigent | MAESFLO | |
| 编程 &与计算软件 | MATLAB | R2021b | 用于数据采集与分析（https://www.mathworks.com/products/matlab.html） |
| PTFE 管 | Cole Parmer | 06417-31 | 0.032" ID × 0.056" (https://www.coleparmer.com/i/masterflex-transfer-tubing-microbore-ptfe-0-032-id-x-0-056-od-100-ft-roll/0641731) |
| Scepter 2.0 手持式自动细胞计数器 | Millapore Sigma | PHCC20060 | https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/mm/phcc20060 |
| 硅片 | Wafer World | 2885 | 76.2 毫米，单面抛光（https://www.waferworld.com/product/2885） |
| 旋涂仪 | n/a | n/a | |
| SU-8 3025 负性光刻胶 | 凯雅库先进材料 | n/a | https://kayakuam.com/products/su-8-2000/ |
| SU8显影液 | 凯库先进材料 | n/a | https://kayakuam.com/products/su-8-developer/ |
| Sygard 184 聚二甲基硅氧烷 | 陶氏化学 | 4019862 | https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/ |
| 胶带 | 透明胶带 | 810-341296 | https://www.staples.com/Scotch-Magic-Tape-810-3-4-x-36-yds-1-Core/product_130567?cid=PS:GS:SBD:PLA:OS&gclid= Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO 2sErRwzrrgjU0NjFkDkne1xm vT7ekS3tdzvAgiMDwPoxocgH VTQZi7vJgaAvQZEALw_wcB |
| 钛、铂、金 | n/a | n/a | |
| 三输出电源供应器 | Keysight | E36311A | https://www.newark.com/keysight-technologies/e36311a/dc-power-supply-3o-p-6v-5a-prog/dp/15AC9653 |
| 紫外光刻掩模对准仪 | Karl Suss America | MJB3 掩模对准器 |
参考文献
- Pegoraro, A. F., Janmey, P., Weitz, D. A. Mechanical properties of the cytoskeleton and cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (11), 022038(2017).
- Kim, J., et al. Characterizing cellular mechanical phenotypes with mec....
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