Rilevamento meccano-nodo-pore: una piattaforma rapida e senza etichette per misure viscoelastiche monocellulari multiparametriche
Summary
Presentato qui è un metodo per fenotipizzare meccanicamente singole cellule utilizzando una piattaforma microfluidica basata sull’elettronica chiamata mechano-node-pore sensing (mechano-NPS). Questa piattaforma mantiene un throughput moderato di 1-10 cellule / s misurando sia le proprietà biofisiche elastiche che viscose delle cellule.
Abstract
Le proprietà meccaniche cellulari sono coinvolte in un’ampia varietà di processi biologici e malattie, che vanno dalla differenziazione delle cellule staminali alle metastasi del cancro. I metodi convenzionali per misurare queste proprietà, come la microscopia a forza atomica (AFM) e l’aspirazione con micropipette (MA), acquisiscono informazioni ricche, riflettendo la risposta viscoelastica completa di una cellula; Tuttavia, questi metodi sono limitati da una velocità effettiva molto bassa. Gli approcci ad alto rendimento, come la citometria a deformabilità in tempo reale (RT-DC), possono misurare solo informazioni meccaniche limitate, poiché sono spesso limitati a letture a singolo parametro che riflettono solo le proprietà elastiche di una cellula. In contrasto con questi metodi, il rilevamento meccano-nodo-poro (mechano-NPS) è una piattaforma microfluidica flessibile e senza etichetta che colma il divario nel raggiungimento di misurazioni viscoelastiche multiparametriche di una cella con throughput moderato. Una misurazione di corrente continua (DC) viene utilizzata per monitorare le cellule mentre transitano su un canale microfluidico, monitorandone le dimensioni e la velocità prima, durante e dopo che sono forzate attraverso una stretta costrizione. Queste informazioni (cioè dimensioni e velocità) vengono utilizzate per quantificare la deformazione trasversale di ogni cellula, la resistenza alla deformazione e il recupero dalla deformazione. In generale, questa piattaforma microfluidica basata sull’elettronica fornisce molteplici proprietà viscoelastiche della cella e quindi un quadro più completo dello stato meccanico di una cella. Poiché richiede una preparazione minima del campione, utilizza una misurazione elettronica semplice (a differenza di una telecamera ad alta velocità) e sfrutta la fabbricazione standard della litografia morbida, l’implementazione di questa piattaforma è semplice, accessibile e adattabile all’analisi a valle. La flessibilità, l’utilità e la sensibilità di questa piattaforma hanno fornito informazioni meccaniche uniche su una vasta gamma di cellule, con il potenziale per molte altre applicazioni nella scienza di base e nella diagnostica clinica.
Introduction
Le singole celle sono materiali viscoelastici dinamici1. Una moltitudine di processi interni ed esterni, (ad esempio, insorgenza di mitosi o rimodellamento della matrice extracellulare [ECM]), influenzano la loro struttura e composizione 2,3,4, spesso risultando in proprietà biofisiche distinte che completano il loro stato attuale. In particolare, le proprietà meccaniche hanno dimostrato di essere importanti biomarcatori dello sviluppo cellulare, della fisiologia e della patologia, fornendo preziose informazioni quantitative che possono integrare gli approcci molecolari e genetici canonici 5,6,7. Ad esempio, Li et al. hanno recentemente descritto le differenze meccaniche tra le cellule di leucemia promielocitica acuta resistenti ai farmaci e quelle responsive, utilizzando anche RNA-seq per scoprire geni associati al citoscheletro differenzialmente espressi8. Comprendendo la complessa interazione tra la meccanica delle singole cellule e la funzione cellulare, la meccanofenotipizzazione ha applicazioni più ampie nella trasformazione della scienza di base e della diagnostica clinica9.
Lo strumento più ampiamente adottato per misurare la meccanica a singola cellula è la microscopia a forza atomica (AFM). Mentre l’AFM consente una misurazione localizzata ad alta risoluzione delle proprietà meccaniche cellulari, rimane limitata a un throughput di <0,01 cellule / s10. In alternativa, le barelle ottiche, che utilizzano due raggi laser divergenti per intrappolare e deformare le singole celle sospese11, sono limitate a portate marginalmente più elevate di <1 cella/s12. I recenti progressi nelle tecnologie microfluidiche hanno permesso una nuova generazione di dispositivi per la valutazione rapida, a cella singola, meccanica12,13. Queste tecniche impiegano stretti canali di costrizione 14,15, flusso di taglio16 o allungamento idrodinamico 17 per deformare rapidamente le cellule a portate di 10-1.000 cellule / s 18. Mentre la velocità di misurazione di questi approcci è considerevolmente più veloce rispetto alle tecniche convenzionali, spesso scambiano capacità ad alto rendimento per letture meccaniche limitate (Tabella supplementare 1). Tutti i suddetti metodi microfluidici rapidi si concentrano su metriche di base a singolo parametro, come il tempo di transito o i rapporti di deformabilità, che riflettono solo le proprietà elastiche di una cella. Tuttavia, data la natura viscoelastica intrinseca delle singole cellule, una caratterizzazione meccanica robusta e completa delle cellule richiede la considerazione non solo dei componenti elastici ma anche delle risposte viscose.
Il rilevamento meccano-nodo-poro (mechano-NPS)2,8 (Figura 1A) è una piattaforma microfluidica che affronta le limitazioni esistenti con la meccanofenotipizzazione a singola cellula. Questo metodo consente la misurazione simultanea di più parametri biofisici, tra cui il diametro della cella, la deformabilità relativa e il tempo di recupero dalla deformazione, con una produttività moderata di 1-10 celle/s. Questa tecnica si basa sul rilevamento dei pori dei nodi (NPS)19,20,21,22,23,24, che prevede l’utilizzo di una misura di sonda a quattro punti per misurare l’impulso di corrente modulata prodotto da una cellula che transita in un canale microfluidico che è stato segmentato da regioni più ampie, denominate “nodi”. L’impulso di corrente modulato è il risultato della cella che blocca parzialmente il flusso di corrente nei segmenti (cioè “pori”) e nei nodi, con più corrente bloccata nel primo che nel secondo. In meccano-NPS, un segmento, il “canale di contrazione”, è più stretto del diametro di una cellula; di conseguenza, una cella deve deformarsi per transitare sull’intero canale (Figura 1B). Il diametro della cellula può essere determinato dall’entità del sottoimpulso prodotto quando la cellula transita nei pori del nodo prima del canale di contrazione (Figure 1B,C). Qui, |ΔInp|, la caduta di corrente quando la cellula è nel poro, è proporzionale al rapporto volumetrico della cellula al poro, cellula V / poro V 2,8,19. La rigidità cellulare può essere determinata da ΔTc, la durata del sottoimpulso drammaticamente più grande prodotto quando la cellula transita nel canale di contrazione (Figure 1B,C). Una cella più rigida impiegherà più tempo a transitare nel canale rispetto a una più morbida 2,8. Infine, il “recupero” cellulare, la capacità della cellula di tornare alla sua dimensione e forma originale dopo la deformazione, può essere determinato dalla serie di sottoimpulsi prodotti mentre la cellula transita nei pori del nodo dopo il canale di contrazione (Figure 1B,C). Il tempo di recupero, ΔTr, è il tempo necessario affinché i sottoimpulsi di corrente ritornino alla grandezza dei sottoimpulsi precedenti, prima che la cella venga schiacciata. Nel complesso, gli impulsi di corrente modulata prodotti al transito di una cellula nel canale microfluidico vengono registrati e analizzati per estrarre i parametri meccanici rilevanti della singola cellula (Figura 1D)2,8.
La riproducibilità e la facilità d’uso di questa piattaforma microfluidica basata sull’elettronica sono state precedentemente dimostrate25. Inoltre, la piattaforma presenta una bassa barriera all’ingresso per la meccanofenotipizzazione unicellulare. La litografia morbida standard viene impiegata per fabbricare dispositivi microfluidici. L’hardware di misura è costituito da componenti economici, tra cui un semplice circuito stampato (PCB), alimentatore, preamplificatore, scheda di acquisizione dati (DAQ) e computer. Infine, è disponibile un codice intuitivo per l’acquisizione e l’analisi dei dati, consentendo un’implementazione semplice. Questa tecnica di meccanofenotipizzazione può distinguere popolazioni di linee cellulari epiteliali mammarie e polmonari non maligne e maligne, discriminare tra i sottolignaggi nelle cellule epiteliali mammarie umane primarie e caratterizzare gli effetti delle perturbazioni citoscheletriche e di altri agenti farmacologici 2,8. Nel complesso, questa piattaforma è un approccio efficace per la meccanofenotipizzazione di singole cellule.
Protocol
Representative Results
Discussion
La misurazione delle proprietà meccaniche delle singole cellule utilizzando questa tecnica di meccanofenotipizzazione consiste in tre fasi: fabbricazione del dispositivo, acquisizione dei dati e analisi dei dati. All’interno di ogni fase, ci sono aspetti notevoli che possono avere un impatto significativo sui risultati sperimentali. Durante la fabbricazione del dispositivo, geometrie di canale coerenti e uniformità da dispositivo a dispositivo sono essenziali per risultati accurati e ripetibili. In particolare, le pare…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni NIBIB 1R01EB024989-01 e NCI 1R01CA190843-01. A. L. e R. R. sono stati supportati da una borsa di ricerca universitaria dell’Associazione H2H8. K. L. C. è stato supportato da una National Science Foundation Graduate Research Fellowship e da una Siebel Scholar Fellowship.
Materials
| Acetone | J.T. Baker | 5356-05 | Purity (GC) ≥ 99.5% (https://us.vwr.com/store/product/6057739/acetone-99-5-vlsi-j-t-baker) |
| Aluminum Foil | n/a | n/a | |
| Analog Low-Pass Filter | ThorLabs | EF504 | ≤240 kHz Passband, Coaxial BNC Feedthrough (https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=EF504#ad-image-0) |
| Biopsy Punch | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | 1mm, Disposable, with Plunger (https://mms.mckesson.com/product/573313/Miltex-33-31AA-P25) |
| Blade | n/a | n/a | |
| BNC Cable | Pomona Electronics | 2249-C-12 | https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/2249-C-12/603323?utm_adgroup=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&utm_source=google&utm_ medium=cpc&utm_campaign= Shopping_Product_Cable%20Assemblies_NEW&utm_term= &utm_content=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&gclid=Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO2sErQqnVJ pj5OXVObuTI8ZUf1ZeIn7zvzGnx mCWdePrG6SdEJMF3X6ubUaAs w-EALw_wcB |
| Cleanroom Polyester Swab | Thermo Fisher Scientific | 18383 | https://www.fishersci.com/shop/products/texwipe-cleantip-alpha-polyester-series-swabs-6/18383 |
| Current Preamplifier | DL Instruments | 1211 | https://www.brltest.com/index.php?main_page=product_info&products_ id=1419 |
| Custom PCB (w/ components) | n/a | n/a | see Supplemental files 4 and 5 |
| DAQ Terminal Block | National Instruments | BNC-2120 | https://www.ni.com/en-in/support/model.bnc-2120.html |
| DAQ to BNC-2110 cable | National Instruments | SHC68-68-EPM | https://www.ni.com/en-in/support/model.shc68-68-epm.html |
| Data Acquisition Board (DAQ) | National Instruments | PCI-6251 | https://www.ni.com/docs/en-US/bundle/pci-6251-feature/page/overview.html |
| Dessicator | Thermo Fisher Scientific | 5311-0250 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/5311-0250 |
| Female BNC To Banana Plug Adapter | Pomona Electronics | 72909 | https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/72909/1196318 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-186 | https://us.vwr.com/store/product/18706419/avantor-seradigm-select-grade-usda-approved-origin-fetal-bovine-serum-fbs |
| Glass Cutter | Chemglass | CG-1179-21 | https://chemglass.com/plate-glass-cutters-diamond-tips |
| Gold Etchant TFA | Transene | NC0977944 | https://www.fishersci.com/shop/products/NC0977944/NC0977944 |
| Hot Plate | Thermo Fisher Scientific | SP131825 | |
| Isopropyl Alcohol | Spectrum Chemical | I1056-4LTPL | Purity (GC) ≥99.5% (https://www.spectrumchemical.com/isopropyl-alcohol-99-percent-fcc-i1056) |
| Metal Hardware Enclosure | Hammond Manufacturing | EJ12126 | https://www.digikey.com/en/products/detail/hammond-manufacturing/EJ12126/2423415 |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Purity (GC) ≥99.8% (https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/substance/methanol320467561) |
| MF-321 Developer | Kayaku Advanced Materials | n/a | https://kayakuam.com/products/mf-321/ |
| MICROPOSIT S1813 Positive Photoresist | DuPont | n/a | https://kayakuam.com/products/microposit-s1800-g2-series-photoresists/ |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010049?SID=srch-hj-10010049 |
| Photomask | Fineline Imaging | n/a | Photomask are custom ordered from our CAD designs (https://www.fineline-imaging.com/) |
| Plain Glass Microscope Slide | Fisher Scientific | 12-553-5B | Material: Soda Lime, L75 x W50 mm, Thickness: 0.90–1.10 mm |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | https://harrickplasma.com/plasma-cleaners/expanded-plasma-cleaner/ |
| Plastic Petri Dish | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | 100 mm (https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-raised-ridge-100-x-15mm/FB0875712) |
| Pressure Controller | Fluigent | MFCS-EZ | https://www.fluigent.com/research/instruments/pressure-flow-controllers/mfcs-series/ |
| Pressure Controller Software | Fluigent | MAESFLO | |
| Programming & Computation Software | MATLAB | R2021b | for data acquisition and analysis (https://www.mathworks.com/products/matlab.html) |
| PTFE Tubing | Cole Parmer | 06417-31 | 0.032" ID x 0.056" (https://www.coleparmer.com/i/masterflex-transfer-tubing-microbore-ptfe-0-032-id-x-0-056-od-100-ft-roll/0641731) |
| Scepter 2.0 Handheld Automatic Cell Counter | Millapore Sigma | PHCC20060 | https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/mm/phcc20060 |
| Silicon Wafer | Wafer World | 2885 | 76.2 mm, Single Side Polished (https://www.waferworld.com/product/2885) |
| Spin Coater | n/a | n/a | |
| SU-8 3025 Negative Photoresist | Kayaku Advanced Materials | n/a | https://kayakuam.com/products/su-8-2000/ |
| SU8 Developer | Kayaku Advanced Materials | n/a | https://kayakuam.com/products/su-8-developer/ |
| Sygard 184 Polydimethlysiloxane | Dow Chemical | 4019862 | https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/ |
| Tape | Scotch | 810-341296 | https://www.staples.com/Scotch-Magic-Tape-810-3-4-x-36-yds-1-Core/product_130567?cid=PS:GS:SBD:PLA:OS&gclid= Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO 2sErRwzrrgjU0NjFkDkne1xm vT7ekS3tdzvAgiMDwPoxocgH VTQZi7vJgaAvQZEALw_wcB |
| Titanium, Platinum, Gold | n/a | n/a | |
| Triple Output Power Supply | Keysight | E36311A | https://www.newark.com/keysight-technologies/e36311a/dc-power-supply-3o-p-6v-5a-prog/dp/15AC9653 |
| UV Mask Aligner | Karl Suss America | MJB3 Mask Aligner |
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