Das vorliegende Protokoll kombiniert Ex-vivo-Stimulation und Durchflusszytometrie, um polyfunktionelle T-Zell-Profile (T PF) in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) bei mit dem Japanischen Enzephalitis-Virus (JEV) geimpften Kindern zu analysieren. Die Detektionsmethode und das Farbschema der Durchflusszytometrie von JEV-spezifischen TPFs wurden getestet, um eine Referenz für ähnliche Studien zu liefern.
Die T-Zell-vermittelte Immunität spielt eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der Flavivirus-Infektion, entweder nach der Impfung oder nach einer natürlichen Infektion. Die “Qualität” einer T-Zelle muss nach Funktion beurteilt werden, und eine höhere Funktion ist mit einem stärkeren Immunschutz verbunden. T-Zellen, die gleichzeitig zwei oder mehr Zytokine oder Chemokine auf Einzelzellebene produzieren können, werden als polyfunktionelle T-Zellen (TPFs) bezeichnet, die Immunantworten durch eine Vielzahl von molekularen Mechanismen vermitteln, um Degranulationsmarker (CD107a) zu exprimieren und Interferon (IFN)-γ, Tumornekrosefaktor (TNF)-α, Interleukin (IL)-2 oder Makrophagen-Entzündungsprotein (MIP)-1α zu sezernieren. Es gibt zunehmend Hinweise darauf, dassT-PFeng mit der Aufrechterhaltung des langfristigen Immungedächtnisses und -schutzes zusammenhängen und dass ihr erhöhter Anteil ein wichtiger Marker für schützende Immunität und wichtig für die wirksame Kontrolle von Virusinfektionen und Reaktivierungen ist. Diese Bewertung gilt nicht nur für spezifische Immunantworten, sondern auch für die Beurteilung von kreuzreaktiven Immunantworten. Hier wurden am Beispiel des Japanischen Enzephalitis-Virus (JEV) die Nachweismethode und das durchflusszytometrische Farbschema von JEV-spezifischenT-PFsgetestet, die von peripheren mononukleären Blutzellen von Kindern produziert werden, die gegen Japanische Enzephalitis geimpft wurden, um eine Referenz für ähnliche Studien zu liefern.
Das Japanische Enzephalitis-Virus (JEV) ist ein wichtiges durch Mücken übertragenes Virus der Gattung Flavivirus innerhalb der Familie Flaviviridae1. Viele asiatisch-pazifische Länder stehen aufgrund der enormen Krankheitslast durch die Japanische Enzephalitis (JE) seit langem vor enormen Herausforderungen für die öffentliche Gesundheit, aber dies hat sich mit der zunehmenden Verfügbarkeit verschiedener Arten von Impfungen dramatisch verbessert2. Adaptive schützende Immunantworten, die durch natürliche Infektionen oder Impfungen hervorgerufen werden, tragen zur Prävention und antiviralen Regulation bei. Humorale Immunität und zellvermittelte Immunität werden als adaptive Immunität klassifiziert, und die Induktion der ersteren wurde immer als Schlüsselstrategie im Impfstoffdesign angesehen, wenn auch mit relativ begrenztem Verständnis in der Vergangenheit3. Die Rolle der T-Zell-vermittelten Immunität bei der Begrenzung der Flavivirusverbreitung und Virusclearance wurde jedoch zunehmend in den Fokus gerückt und umfassend untersucht4. Darüber hinaus ist die T-Zell-Immunität nicht nur für JEV-spezifische antivirale Reaktionen unverzichtbar, sondern spielt auch eine herausragende Rolle beim Kreuzschutz vor Sekundärinfektionen mit heterologen Flaviviren, was in früheren Studien gezeigt wurde5. Es wird spekuliert, dass dieser Effekt potenzielle Antikörper-vermittelte Verstärkungseffekte bei Infektion umgehen kann5. Bemerkenswert ist, dass eine solche kreuzreaktive T-Zell-Immunität wichtig ist, insbesondere in Abwesenheit von Impfstoffen und antiviralen Medikamenten gegen Flaviviren. Obwohl viele Studien durchgeführt wurden, um den Beitrag von T-Zellen bei der JEV-Infektion in Bezug auf CD4+ und CD8+ T-Zellen6,7 zu bestimmen, bleiben die jeweiligen Linien der Zytokine und ihre funktionelle Diversifizierung unbestimmt, was bedeutet, dass die Aufklärung der genauen Funktionen von Helfer- und Killer-T-Zellen behindert wird.
Das Ausmaß ihrer antiviralen Abwehrkräfte bestimmt die Qualität der T-Zell-Antworten. CD4+ oder CD8+ T-Zellen, die kompatibel zwei oder mehr Funktionen übertragen können, einschließlich Zytokinsekretion und Degranulation, werden bei spezifischer Stimulation auf Einzelzellebene als polyfunktionelle T-Zellen (TPFs) charakterisiert8. CD4+ T-Zellen, die einzelne oder mehrere Zytokine produzieren, können verschiedene Wirkungen und Immungedächtnisse haben. Zum Beispiel bilden IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T-Zellen eher eine langfristig wirksame Schutzreaktion als IL-2+ CD4+ T-Zellen9, was als wichtiger Parameter zur Bewertung des Impfeffekts verwendet werden kann. Die Häufigkeit von IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T-Zellen ist bei Patienten mit langfristiger Nicht-Progression des erworbenen Immunschwächesyndroms (AIDS) erhöht, während CD4+ T-Zellen bei Patienten mit AIDS-Progression aufgrund der fördernden Wirkung von IL-2 auf die T-Zellproliferationeher dazu neigen, IFN-γ allein zu produzieren. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass eine Untergruppe von IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+ langfristig in vivo überlebt und die Tötungsfunktion synergistisch fördert11. Obwohl CD8+ T-Zellen eher zytotoxische Aktivität aufweisen, sind einige CD4+ T-Zellen auch mit zytotoxischer Aktivität als indirekt nachgewiesene Expression von Oberflächen-CD107a-Molekülenausgestattet 12. Darüber hinaus exprimieren bestimmte T-Zell-Untergruppen das Chemokin MIP-1α, das oft von Monozyten sezerniert wird, um an der T-Zell-vermittelten Neutrophilenrekrutierung teilzunehmen13. In ähnlicher Weise können CD8+ TPFs auch verwendet werden, um die Vielseitigkeit der oben genannten Marker zu charakterisieren. Studien haben gezeigt, dass die Prime-Boost-Strategie effektiv einen längeren Zeitraum von T-PF-Schutzwirkungen induzieren kann13, was den durch die Impfung hervorgerufenen Schutz verstärken kann. Ein zentrales Merkmal bei der Untersuchung des Immunsystems ist die Fähigkeit von Gedächtnis-T-Zellen, stärkere, schnellere und effektivere Reaktionen auf sekundäre virale Herausforderungen zu ermöglichen als naive T-Zellen. Effektorgedächtnis-T-Zellen (T EM) und zentrale Gedächtnis-T-Zellen (T CM) sind wichtige T-Zell-Untergruppen, die oft durch die zusammengesetzte Expression von CD27/CD45RO oder CCR7/CD45RA 14 unterschieden werden. TCM (CD27+ CD45RO+ oder CCR7+ CD45RA-) neigt dazu, sich in sekundären lymphatischen Geweben zu lokalisieren, während TEM (CD27- CD45RO+ oder CCR7- CD45RA–) in lymphatischen und peripheren Geweben lokalisiert15,16. TEM bietet eine sofortige, aber nicht anhaltende Abwehr, während TCM die Reaktion aufrechterhält, indem es sich in den sekundären lymphatischen Organen vermehrt und neue Effektoren erzeugt17. Da Gedächtniszellen spezifische und effiziente Erinnerungsreaktionen auf Viren vermitteln können, stellen sich Fragen nach dem Beitrag dieser Untergruppe von Polyfunktionen.
Mit der Entwicklung der Durchflusszytometrie-Technologie ist es üblich geworden, Marker von mehr als 10 Clustern, Phänotypen und Differenzierungsantigenen gleichzeitig zu erkennen, was vorteilhaft ist, um die funktionellen immunologischen Merkmale einzelner T-Zellen besser zu kommentieren, um Fehlinterpretationen und Schwierigkeiten beim Verständnis von T-Zell-Phänotypen zu reduzieren. Diese Studie verwendete Ex-vivo-Stimulation und Durchflusszytometrie, umT-PF-Profile in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) bei JEV-geimpften Kindern zu analysieren. Mit diesem Ansatz wird das Verständnis der kurz- und langfristigen JEV-spezifischen und sogar kreuzreaktiven T-Zell-Immunität, die durch Impfung induziert wird, erweitert.
Dieses Protokoll stellt eine praktikable Durchflusszytometrie-basierte Nachweismethode fürT-PF-Profile in den PBMCs von Kindern dar, die mit dem JEV-Impfstoff SA14-14-2 geimpft wurden. Diese Studie verwendete die venösen Blut-PBMCs von geimpften und ungeimpften Kindern als Forschungsmaterialien. Mit der Stimulation von PBMCs mit dem JEV-Antigen können diese amplifizierten antigenspezifischenT-PFsdurch mehrfarbige Durchflusszytometrie-Antikörperfärbung charakterisiert werden. Im Vergleich zur he…
The authors have nothing to disclose.
R.W. wurde von der National Natural Science Foundation of China (82002130) und der Beijing Natural Science Foundation of China (7222059) unterstützt. ZD.X. wurde vom CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-026) unterstützt.
anti-human CD28 | Biolegend | 302934 | Antibody |
anti-human CD49d | Biolegend | 304339 | Antibody |
APC anti-human MIP-1α | BD | 551533 | Fluorescent antibody |
Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
BD FACSymphony A5 | BD | A5 | flow Cytometry |
BUV395 anti-human CD4 | BD | 563550 | Fluorescent antibody |
BUV737 anti-human CCR7 | BD | 741786 | Fluorescent antibody |
BUV737 anti-human CD27 | BD | 612829 | Fluorescent antibody |
BV421 anti-human CD8 | Biolegend | 344748 | Fluorescent antibody |
BV480 anti-human CD45RA | BD | 566114 | Fluorescent antibody |
BV480 anti-human CD45RO | BD | 566143 | Fluorescent antibody |
BV605 anti-human CD107a | Biolegend | 328634 | Fluorescent antibody |
BV650 anti-human CD3 | BD | 563999 | Fluorescent antibody |
BV785 anti-human IL-2 | Biolegend | 500348 | Fluorescent antibody |
Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | Cell fixation and permeabilization |
Density gradient medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium |
FITC anti-human IFN-γ | Biolegend | 502506 | Fluorescent antibody |
Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
Gibco RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 22400089 | cell culture medium |
High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
PE anti-human TNF-α | Biolegend | 502909 | Fluorescent antibody |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug) | BD | 555029 | blocks intracellular protein transport processes |
Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD | 554724 | blocks intracellular protein transport processes |
Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |
Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
Zombie NIR Fixable Viability Dye | Biolegend | 423106 | Dead cell stain |