フローサイトメトリー法 による 日本脳炎ワクチン接種小児における多機能性T細胞の検出
Summary
本プロトコルは、 ex vivo 刺激とフローサイトメトリーを組み合わせて、日本脳炎ウイルス(JEV)ワクチン接種小児内の末梢血単核球(PBMC)の多機能T細胞(TFP)プロファイルを分析します。JEV特異的TPFの検出方法とフローサイトメトリーの配色を試験し、同様の研究の参考資料を提供しました。
Abstract
T細胞媒介免疫は、ワクチン接種後または自然感染後のフラビウイルス感染の制御に重要な役割を果たします。T細胞の「品質」は機能によって評価する必要があり、より高い機能はより強力な免疫防御と関連しています。単一細胞レベルで2つ以上のサイトカインまたはケモカインを同時に産生できるT細胞は、多機能性T細胞(TFPs)と呼ばれ、さまざまな分子メカニズムを介して免疫応答を仲介し、脱顆粒マーカー(CD107a)を発現し、インターフェロン(IFN)-γ、腫瘍壊死因子(TNF)-α、インターロイキン(IL)-2、またはマクロファージ炎症タンパク質(MIP)-1αを分泌します。TFPは長期的な免疫記憶と保護の維持に密接に関連しており、その割合の増加は防御免疫の重要なマーカーであり、ウイルス感染と再活性化の効果的な制御に重要であるという証拠が増えています。この評価は、特異的免疫応答だけでなく、交差反応性免疫応答の評価にも適用されます。ここでは、日本脳炎ウイルス(JEV)を例にとり、日本脳炎の予防接種を受けた小児の末梢血単核球によって産生されるJEV特異的TFPsの検出方法およびフローサイトメトリーの配色を試験し、同様の研究の参考とした。
Introduction
日本脳炎ウイルス(JEV)は、フラビウイルス科1に属するフラビウイルス属に属する重要な蚊媒介性ウイルスです。多くのアジア太平洋諸国は、日本脳炎(JE)によって引き起こされる莫大な病気の負担のために長い間大きな公衆衛生上の課題に直面してきましたが、これはさまざまな種類の予防接種の利用可能性の増加とともに劇的に改善されました2。自然感染またはワクチン接種によって引き起こされる適応防御免疫応答は、予防および抗ウイルス調節に寄与する。体液性免疫と細胞性免疫は獲得免疫に分類され、前者の誘導は、過去3では比較的限られた理解しかありませんでしたが、ワクチン設計における重要な戦略として常に見なされてきました。しかし、フラビウイルスの蔓延とウイルスクリアランスを制限する上でのT細胞媒介免疫の役割はますます注目され、広く研究されています4。さらに、T細胞免疫は、JEV特異的抗ウイルス反応に不可欠であるだけでなく、以前の研究で実証されている異種フラビウイルスによる二次感染からの交差防御においても重要な役割を果たしています5。この効果は、感染症における潜在的な抗体媒介増強効果を回避する可能性があると推測されています5。注目すべきことに、このような交差反応性T細胞免疫は、特にフラビウイルスに対するワクチンおよび抗ウイルス薬が存在しない場合に重要である。CD4+およびCD8+ T細胞に関してJEV感染におけるT細胞の寄与を決定するために多くの研究が行われてきたが6,7、サイトカインを分泌するそれぞれの系統とその機能多様化は未定のままであり、これはヘルパーおよびキラーT細胞の正確な機能の解明が妨げられていることを意味する。
それらの抗ウイルス防御の規模は、T細胞応答の質を決定する。サイトカイン分泌および脱顆粒を含む2つ以上の機能を相溶的に付与することができるCD4+またはCD8+ T細胞は、単一細胞レベルでの特異的刺激に対して多機能性T細胞(TFs)として特徴付けられる8。単一または複数のサイトカインを産生するCD4+ T細胞は、さまざまな効果と免疫記憶を持っている可能性があります。例えば、IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T細胞は、IL-2+ CD4+ T細胞よりも長期的に有効な防御応答を形成する可能性が高く、ワクチン接種効果を評価する際の重要なパラメータとして使用できます。IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T細胞の頻度は、後天性免疫不全症候群(AIDS)の長期非進行の患者で増加しますが、エイズ進行患者のCD4+ T細胞は、T細胞増殖に対するIL-2の促進効果により、IFN-γ単独で産生する傾向があります10。さらに、IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+のサブセットは、in vivoで長期間生存し、殺傷機能を相乗的に促進することが示されました11。CD8+ T細胞は細胞傷害活性を示す可能性が高いが、一部のCD4+ T細胞は、表面CD107a分子の発現を間接的に検出する12として細胞傷害活性も備えている。さらに、特定のT細胞サブセットはケモカインMIP-1αを発現し、これはT細胞媒介好中球動員に関与するために単球によって分泌されることが多い13。同様に、CD8+ TPFsは、上記のマーカーの汎用性を特徴付けるためにも使用できます。研究によると、プライムブースト戦略は、ワクチン接種によって誘発される保護を強化することができるTf保護効果13の長期間を効果的に誘発することができます。免疫系を調べる際の中心的な特徴は、記憶T細胞がナイーブT細胞よりも二次的なウイルスの課題に対してより強く、より速く、より効果的な応答を促進する能力です。エフェクターメモリーT細胞(TEM)および中枢メモリーT細胞(TCM)は、CD27/CD45ROまたはCCR7/CD45RAの複合発現によってしばしば分化される重要なT細胞サブセットである14。TCM(CD27+ CD45RO+またはCCR7+ CD45RA-)は二次リンパ組織に局在する傾向があり、TEM(CD27-CD45RO+またはCCR7-CD45RA–)はリンパ系および末梢組織に局在する15,16。TEMは即時の、しかし持続的ではない防御を提供するのに対し、TCMは、二次リンパ器官で増殖し、新しいエフェクターを生成することによって応答を維持する17。したがって、メモリセルがウイルスに対する特異的で効率的な想起応答を媒介できることを考えると、この多関数のサブセットの寄与について疑問が生じます。
フローサイトメトリー技術の発展に伴い、10を超えるクラスター、表現型、分化抗原のマーカーを同時に検出することが一般的になり、個々のT細胞の機能的免疫学的特徴をより豊富にアノテーションして、T細胞の表現型の誤解や理解の難しさを減らすのに役立ちます。この研究では、 ex vivo 刺激とフローサイトメトリーを使用して、JEVワクチン接種を受けた子供の末梢血単核細胞(PBMC)のTFP プロファイルを分析しました。このアプローチを適用することで、ワクチン接種によって誘導される短期および長期のJEV特異的、さらには交差反応性T細胞免疫の理解が拡大されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、JEVワクチンSA14-14-2を接種した小児のPBMCにおけるTFP プロファイルの実行可能なフローサイトメトリーベースの検出方法を表しています。この研究では、ワクチン接種を受けた子供と予防接種を受けていない子供の両方の静脈血PBMCを研究資料として使用しました。JEV抗原によるPBMCの刺激により、増幅された抗原特異的TFPsは、多色フローサイトメトリー抗体?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R.W.は、中国国家自然科学基金会(82002130)、中国北京自然科学基金会(7222059)の支援を受けました。ZD.X.は、CAMSイノベーション・ファンド・フォー・メディカルサイエンス(2019-I2M-5-026)の支援を受けました。
Materials
| anti-human CD28 | Biolegend | 302934 | Antibody |
| anti-human CD49d | Biolegend | 304339 | Antibody |
| APC anti-human MIP-1α | BD | 551533 | Fluorescent antibody |
| Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
| BD FACSymphony A5 | BD | A5 | flow Cytometry |
| BUV395 anti-human CD4 | BD | 563550 | Fluorescent antibody |
| BUV737 anti-human CCR7 | BD | 741786 | Fluorescent antibody |
| BUV737 anti-human CD27 | BD | 612829 | Fluorescent antibody |
| BV421 anti-human CD8 | Biolegend | 344748 | Fluorescent antibody |
| BV480 anti-human CD45RA | BD | 566114 | Fluorescent antibody |
| BV480 anti-human CD45RO | BD | 566143 | Fluorescent antibody |
| BV605 anti-human CD107a | Biolegend | 328634 | Fluorescent antibody |
| BV650 anti-human CD3 | BD | 563999 | Fluorescent antibody |
| BV785 anti-human IL-2 | Biolegend | 500348 | Fluorescent antibody |
| Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | Cell fixation and permeabilization |
| Density gradient medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium |
| FITC anti-human IFN-γ | Biolegend | 502506 | Fluorescent antibody |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
| Gibco RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 22400089 | cell culture medium |
| High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
| Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| PE anti-human TNF-α | Biolegend | 502909 | Fluorescent antibody |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
| Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug) | BD | 555029 | blocks intracellular protein transport processes |
| Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD | 554724 | blocks intracellular protein transport processes |
| Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |
| Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
| Zombie NIR Fixable Viability Dye | Biolegend | 423106 | Dead cell stain |
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