면역형광 분석을 통한 환자 유래 난소암 오가노이드의 DNA 손상 복구 단백질 시각화
Summary
본 프로토콜은 환자 유래 난소암 오가노이드에서 DNA 손상 복구 단백질을 평가하는 방법을 설명합니다. 여기에는 포괄적인 도금 및 염색 방법과 상세하고 객관적인 정량 절차가 포함됩니다.
Abstract
면역형광법은 높은 감도와 특이성으로 표적 항원을 시각화하는 데 가장 널리 사용되는 기술 중 하나로, 단백질, 글라이칸 및 저분자의 정확한 식별 및 국소화를 가능하게 합니다. 이 기술은 2차원(2D) 세포 배양에서 잘 확립되어 있지만 3차원(3D) 세포 모델에서의 사용에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 난소암 오가노이드는 종양 세포 클론 이질성, 종양 미세 환경, 세포-세포 및 세포-기질 상호작용을 요약하는 3D 종양 모델입니다. 따라서 약물 감수성 및 기능적 바이오마커 평가를 위해 세포주보다 우수합니다. 따라서 원발성 난소암 오가노이드에 면역형광을 활용하는 능력은 이 암의 생물학을 이해하는 데 매우 유용합니다. 현재 연구는 고급 장액성 환자 유래 난소암 오가노이드(PDO)에서 DNA 손상 복구 단백질을 검출하기 위한 면역형광 기술을 설명합니다. PDO를 전리 방사선에 노출시킨 후, 핵 단백질을 초점으로 평가하기 위해 온전한 오가노이드에 대해 면역형광을 수행합니다. 이미지는 컨포칼 현미경에서 z-스택 이미징을 사용하여 수집되고 자동 초점 계수 소프트웨어를 사용하여 분석됩니다. 설명된 방법을 통해 DNA 손상 복구 단백질의 시간적 및 특수 모집 및 이러한 단백질과 세포주기 마커의 공동 국소화를 분석할 수 있습니다.
Introduction
난소암은 부인과 악성 종양으로 인한 주요 사망 원인입니다. 대다수의 환자는 카보플라틴과 같은 DNA 손상 약물로 치료받으며, 상동 재조합 복구(HRR) 결핍 종양이 있는 환자에게는 폴리(ADP-리보스) 중합효소(PARP) 억제제를 투여할 수 있다 1,2. 그러나 대부분의 환자는 이러한 요법에 내성이 생기고 진단 후 5년 이내에 사망합니다. DNA 손상 반응(DDR)의 조절장애는 난소암의 발생과 화학요법 및 PARP 억제제 내성 둘 다와 연관되었다3. 따라서 DDR에 대한 연구는 난소암의 병태생리학, 잠재적인 바이오마커 및 새로운 표적 치료법을 이해하는 데 필수적입니다.
DDR을 평가하는 현재의 방법은 면역형광법(IF)을 활용하는데, 이를 통해 DNA 손상 단백질과 뉴클레오티드 유사체의 정확한 식별 및 국소화가 가능합니다. DNA에 이중 가닥 절단(DSB)이 생기면 히스톤 단백질 H2AX가 빠르게 인산화되어 DNA 손상 복구 단백질이 모이는 초점을 형성합니다4. 이러한 인산화는 IF를 이용하여 쉽게 확인할 수 있다; 사실, ɣ-H2AX 분석은 일반적으로 DSB 5,6,7,8,9의 유도를 확인하는 데 사용되었습니다. 증가된 DNA 손상은 백금 감수성 및 DNA 손상제의 효능과 관련이 있으며10,11,12, ɣ-H2AX는 다른 암 치료에서 화학요법 반응과 관련된 바이오마커로 제안되었다 13. DSB에서 HRR에 능숙한 세포는 BRCA1 및 BRCA2가 복제 단백질 A(RPA)를 대체하고 DNA에 결합하기 위해 RAD51을 모집하도록 하는 일련의 이벤트를 수행합니다. HRR 복구는 DNA 템플릿을 사용하여 DSB를 충실하게 복구합니다. 그러나 종양에 HRR이 결핍되면 NHEJ(Non-homologous End Joining)와 같은 대체 복구 경로에 의존합니다. NHEJ는 오류가 발생하기 쉬운 것으로 알려져 있으며 53BP1을 양성 조절자(14)로 사용하는 세포에 높은 돌연변이 부담을 유발합니다. 이러한 DNA 손상 단백질은 모두 IF를 사용하여 초점으로 정확하게 식별 할 수 있습니다. 단백질 염색 외에도 IF는 포크 보호 및 단일 가닥 DNA 갭 형성을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 안정한 포크를 갖는 능력은 백금 반응과 상관관계가 있으며, 최근에, 갭 검정은 PARP 억제제 6,15,16,17에 대한 반응을 예측할 수 있는 가능성을 보여주었다. 따라서 게놈에 도입된 후 뉴클레오티드 유사체에 대한 염색은 DDR을 연구하는 또 다른 방법입니다.
현재까지, 난소암에서 DDR의 평가는 생체 내 종양의 클론 이질성, 미세 환경 또는 구조를 재현하지 않는 균질한 2D 세포주로 크게 제한되었습니다18,19. 최근 연구에 따르면 오가노이드는 DDR 메커니즘과 같은 복잡한 생물학적 과정을 연구하는 데 있어 2차원 세포주보다 우수합니다6. 본 방법론은 PDO에서 RAD51, ɣ-H2AX, 53BP1, RPA 및 게미닌을 평가합니다. 이러한 방법은 온전한 오가노이드를 평가하고 생체 내 종양 미세 환경과 더 유사한 환경에서 DDR 메커니즘을 연구할 수 있도록 합니다. 컨포칼 현미경 및 자동 병소 계수와 함께 이 방법론은 난소암의 DDR 경로를 이해하고 환자를 위한 치료 계획을 개인화하는 데 도움이 될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA 손상 반응은 난소암의 발병과 화학요법 내성 모두에 필수적인 역할을 합니다. 따라서 DNA 복구 메커니즘에 대한 철저한 이해가 필수적입니다. 여기에서는 DNA 손상 복구 단백질을 3D, 온전한 오가노이드로 연구하는 방법론을 제시합니다. 재현 가능하고 신뢰할 수 있는 프로토콜은 DNA 손상, 상동 재조합, 비상동 말단 결합 및 복제 스트레스를 평가하기 위해 특징적인 항체를 사용하여 개발됩니다. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로토콜을 수립하는 데 있어 Pavel Lobachevsky 박사의 지도에 감사드립니다. 또한 이 프로젝트를 지원해 주신 세인트루이스 산부인과 및 부인과 종양학과의 워싱턴 대학교 의과대학, 워싱턴 대학교 학장 장학생 프로그램, 부인과 종양학 그룹 재단 및 생식 과학자 개발 프로그램에 감사드립니다.
Materials
| 1x phosphate buffered saline with calcium and magnesium (PBS++) | Sigma | 14-040-133 | |
| 1x phosphate buffered saline without calcium and magnesium (PBS) | Fisher Scientific | ICN1860454 | |
| Ant-53BP1 Antibody | BD Biosciences | 612522 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-Geminin Antibody | Abcam | ab104306 | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Anti-Geminin Antibody | ProteinTech | 10802-1-AP | diluted to 1:400 in staining buffer |
| Anti-RAD51 Antibody | Abcam | ab133534 | diluted to 1:1000 in staining buffer |
| Anti-yH2AX Antibody | Millipore-Sigma | 05-636 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) Antibody | Bethyl Laboratories | A300-245A-M | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 100 | |
| Centrifuge; Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004240 | |
| Confocal Microscope, Leica SP5 confocal system DMI4000 | Leica | 389584 | |
| Conical Tubes, 15 mL | Corning | 14-959-53A | |
| Countess 3 FL Automated Cell Counter (Cell Counting Machine) | Thermo Scientific | AMQAF2000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Scientific | C10228 | |
| Cover Slip | LA Colors | Any clear nail polish will suffice | |
| Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | Could probably use Matrigel or other BME Matrix |
| DAPI | Thermo Scientific | R37606 | NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent, Diluted in 1x PBS |
| Glycine | Fisher Scientific | NC0756056 | |
| JCountPro | JCountPro | For access to the software, Email: jcountpro@gmail.com | |
| Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 07-000-243 | |
| Nail Polish | StatLab | SL102450 | |
| Parafomraldehyde (PFA), 2% | Electron Microscopy Sciences | 157-4 | Dilute to 4% PFA in PBS++ to obtain 2% PFA |
| Permeabilization Buffer | Made in Lab | 0.2% X-100 Triton in PBS++ | |
| Pipette | Rainin | 17014382 | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014967 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36930 | |
| Staining Buffer | Made in Lab | 0.5% BSA, 0.15% Glycine, 0.1% X-100 Triton in PBS++ | |
| Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 12-565-8 | |
| Triton X-100 | Sigma-Alderich | 11332481001 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
| X-RAD 320 Biological Irradiator | Precision X-Ray Irradiation | X-RAD320 |
References
- Lheureux, S., Gourley, C., Vergote, I., Oza, A. M. Epithelial ovarian cancer. Lancet Oncology. 393 (10177), 1240-1253 (2019).
- Tew, W. P., et al. PARP inhibitors in the management of ovarian cancer: ASCO guideline. Journal of Clinical Oncology. 38 (30), 3468-3493 (2020).
- Tomasova, K., et al. DNA repair and ovarian carcinogenesis: impact on risk, prognosis and therapy outcome. Cancers. 12 (7), 1713 (2020).
- Mukhopadhyay, A., et al. Development of a functional assay for homologous recombination status in primary cultures of epithelial ovarian tumor and correlation with sensitivity to poly(ADP-Ribose) polymerase inhibitors. Clinical Cancer Research. 16 (8), 2344-2351 (2010).
- Graeser, M., et al. A marker of homologous recombination predicts pathologic complete response to neoadjuvant chemotherapy in primary breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (24), 6159-6168 (2010).
- Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).
- Naipal, K. A. T., et al. Functional ex vivo assay to select homologous recombination-deficient breast tumors for PARP inhibitor treatment. Clinical Cancer Research. 20 (18), 4816-4826 (2014).
- Tumiati, M., et al. A functional homologous recombination assay predicts primary chemotherapy response and long-term survival in ovarian cancer patients. Clinical Cancer Research. 24 (18), 4482-4493 (2018).
- Mukhopadhyay, A., et al. Clinicopathological features of homologous recombination-deficient epithelial ovarian cancers: sensitivity to PARP inhibitors, platinum, and survival. 癌症研究. 72 (22), 5675-5682 (2012).
- Johnson, S. W., Laub, P. B., Beesley, J. S., Ozols, R. F., Hamilton, T. C. Increased platinum-DNA damage tolerance is associated with cisplatin resistance and cross-resistance to various chemotherapeutic agents in unrelated human ovarian cancer cell lines. 癌症研究. 57 (5), 850-856 (1997).
- Stefanou, D. T., et al. Aberrant DNA damage response pathways may predict the outcome of platinum chemotherapy in ovarian cancer. PLoS One. 10 (2), 0117654 (2015).
- Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. DNA repair pathways as targets for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 8 (3), 193-204 (2008).
- Ivashkevich, A., Redon, C. E., Nakamura, A. J., Martin, R. F., Martin, O. A. Use of the γ-H2AX assay to monitor DNA damage and repair in translational cancer research. Cancer Letters. 327 (1-2), 123-133 (2012).
- Fuh, K., et al. Homologous recombination deficiency real-time clinical assays, ready or not. Gynecologic Oncology. 159 (3), 877-886 (2020).
- Cong, K., et al. Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency. Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).
- Lee, E. K., Matulonis, U. A. PARP inhibitor resistance mechanisms and implications for post-progression combination therapies. Cancers. 12 (8), 2054 (2020).
- Panzarino, N. J., et al. Replication gaps underlie BRCA deficiency and therapy response. 癌症研究. 81 (5), 1388-1397 (2021).
- Yee, C., Dickson, K. A., Muntasir, M. N., Ma, Y., Marsh, D. J. Three-dimensional modelling of ovarian cancer: from cell lines to organoids for discovery and personalized medicine. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 836984 (2022).
- Regan, J. L. Immunofluorescence staining of colorectal cancer patient-derived organoids. Methods Cell Biology. 171, 163-171 (2022).
- Graham, O., et al. Generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient derived organoids. Journal of Visualized Experiments. (191), (2023).
- Jakl, L., et al. Validation of JCountPro software for efficient assessment of ionizing radiation-induced foci in human lymphocytes. International Journal of Radiation Biology. 92 (12), 766-773 (2016).
- Mullen, M. M., et al. GAS6/AXL inhibition enhances ovarian cancer sensitivity to chemotherapy and PARP inhibition through increased DNA damage and enhanced replication stress. Molecular Cancer Research. 20 (2), 265-279 (2022).
- van Ineveld, R. L., Ariese, H. C. R., Wehrens, E. J., Dekkers, J. F., Rios, A. C. Single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids. Journal of Visualized Experiments. (160), e60709 (2020).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- O’Rourke, K. P., Dow, L. E., Lowe, S. W. Immunofluorescent staining of mouse intestinal stem cells. Bio Protocols. 6 (4), 1732 (2016).
- Nwani, N. G., Sima, L. E., Nieves-Neira, W., Matei, D. Targeting the microenvironment in high grade serous ovarian cancer. Cancers. 10 (8), 266 (2018).
- Ghoneum, A., et al. Exploring the clinical value of tumor microenvironment in platinum-resistant ovarian cancer. Seminars in Cancer Biology. 77, 83-98 (2021).
- Yang, Y., Yang, Y., Yang, J., Zhao, X., Wei, X. Tumor microenvironment in ovarian cancer: function and therapeutic strategy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 758 (2020).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Cybulla, E., Vindigni, A. Leveraging the replication stress response to optimize cancer therapy. Nature Reviews. , (2022).
