JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
自动翻译
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
免疫与感染

القياس في الوقت الحقيقي لملف الطاقة الحيوية للميتوكوندريا للعدلات

Published: June 02, 2023
doi:
10.3791/64971
, ,
1Department of Immunology, School of Medicine,UConn Health, 2Arthritis and Clinical Immunology Program,Oklahoma Medical Research Foundation, 3Department of Microbiology and Immunology,University of Oklahoma Health Science Center

Summary

نصف بروتوكولات متدرجة تقيس تنفس الميتوكوندريا للفأر والعدلات البشرية وخلايا HL60 باستخدام محلل التدفق الأيضي خارج الخلية.

Abstract

العدلات هي خط الدفاع الأول والكريات البيض الأكثر وفرة في البشر. تؤدي هذه الخلايا المستجيبة وظائف مثل البلعمة والانفجار التأكسدي ، وتخلق مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) لإزالة الميكروبات. تتحدى رؤى جديدة حول الأنشطة الأيضية للعدلات المفهوم المبكر بأنها تعتمد بشكل أساسي على تحلل السكر. يمكن أن يكشف القياس الدقيق للأنشطة الأيضية عن المتطلبات الأيضية المختلفة للعدلات ، بما في ذلك دورة حمض الكربوكسيل (TCA) (المعروفة أيضا باسم دورة كريبس) ، والفسفرة التأكسدية (OXPHOS) ، ومسار فوسفات البنتوز (PPP) ، وأكسدة الأحماض الدهنية (FAO) في ظل الظروف الفسيولوجية وفي حالات المرض. تصف هذه الورقة بروتوكولا خطوة بخطوة ومتطلبات مسبقة لقياس معدل استهلاك الأكسجين (OCR) كمؤشر على تنفس الميتوكوندريا على العدلات المشتقة من نخاع عظم الفأر ، والعدلات المشتقة من دم الإنسان ، وخط خلية HL60 الشبيه بالعدلات ، باستخدام تحليل التدفق الأيضي على محلل التدفق الأيضي خارج الخلية. يمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد وظائف الميتوكوندريا للعدلات في ظل الظروف العادية والمرضية.

Introduction

تلعب الميتوكوندريا دورا رئيسيا في الطاقة الحيوية للخلايا ، والتي تولد أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) عن طريق الفسفرة التأكسدية (OXPHOS). بالإضافة إلى ذلك ، يمتد دور الميتوكوندريا إلى توليد وإزالة السموم من أنواع الأكسجين التفاعلية ، وتنظيم الكالسيوم في مصفوفة السيتوبلازم والميتوكوندريا ، والتوليف الخلوي ، والهدم ، ونقل المستقلبات داخل الخلية1. يعد تنفس الميتوكوندريا ضروريا في جميع الخلايا ، حيث يمكن أن يؤدي اختلالها الوظيفي إلى مشاكل التمثيل الغذائي 2 ، بما في ذلك أمراض القلب والأوعية الدموية3 ومجموعة متنوعة من الأمراض التنكسية العصبية ، مثل التنكس البقعي المرتبط بالعمر4 ، وأمراض باركنسون والزهايمر5 ، ومرض شاركو ماري توث2 أ (CMT2A) 6.

كشفت الدراسات المجهرية الإلكترونية على العدلات أن هناك عددا قليلا نسبيا من الميتوكوندريا7 ، وأنها تعتمد بشكل كبير على تحلل السكر لإنتاج الطاقة لأن معدلات التنفس الميتوكوندريا منخفضة جدا8. ومع ذلك ، فإن الميتوكوندريا ضرورية لوظائف العدلات ، مثل الانجذاب الكيميائي9 وموت الخلايا المبرمج10،11،12. كشفت دراسة سابقة عن وجود شبكة ميتوكوندريا معقدة في العدلات البشرية ذات إمكانات غشائية عالية. يعد فقدان غشاء الميتوكوندريا المحتمل مؤشرا مبكرا على موت الخلايا المبرمجالعدلات 10. أظهرت المعالجة باستخدام غير مقرنة الميتوكوندريا كربونيل سيانيد m-chlorophenyl hydrazone (CCCP) تثبيطا كبيرا في الانجذاب الكيميائي ، إلى جانب تغيير في مورفولوجيا الميتوكوندريا 9,10.

على الرغم من أن مصدر الطاقة الأساسي للعدلات هو تحلل السكر ، إلا أن الميتوكوندريا توفر ATP الذي يبدأ تنشيط العدلات عن طريق تغذية المرحلة الأولى من إشارات البيورينرجيك ، والتي تعزز إشارات Ca2+ ، وتضخم إنتاج ATP الميتوكوندريا ، وتبدأ الاستجابات الوظيفيةللعدلات 13. يؤدي خلل في السلسلة التنفسية للميتوكوندريا إلى الإفراط في إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية السامة (ROS) ويؤدي إلى أضرار مسببة للأمراض14،15،16. NETosis ، وهي عملية تشكيل مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) ، هي خاصية مهمة للعدلات تساعدها على محاربة مسببات الأمراض17 وتساهم في العديد من الحالات المرضية ، بما في ذلك السرطان والتخثر واضطرابات المناعة الذاتية18. يساهم أنواع الأكسجين التفاعلية المشتقة من الميتوكوندريا في NETosis19 ، ويمكن أن يكون الحمض النووي للميتوكوندريا مكونا من مكونات NETs18 ، كما أن توازن الميتوكوندريا المتغير يضعف NETosis20،21،22،23،24. علاوة على ذلك ، أثناء التمايز الطبيعي أو النضج ، يتم عكس إعادة برمجة التمثيل الغذائي للعدلات عن طريق الحد من نشاط تحلل السكر ، ويشاركون في تنفس الميتوكوندريا ويحشدون الدهون داخل الخلايا25,26.

يمكن لمحلل التدفق الأيضي خارج الخلية مراقبة وقياس تنفس الميتوكوندريا للخلايا الحية وتحلل السكر باستمرار. يستخدم المحلل خرطوشة مستشعر بتنسيق لوحة 96 بئرا واثنين من الفلوروفور لتحديد تركيز الأكسجين (O2) وتغيرات الأس الهيدروجيني. خرطوشة المستشعر فوق الطبقة الأحادية للخلية أثناء الفحص وتشكل غرفة دقيقة بارتفاع ~ 200 نانومتر. تستخدم حزم الألياف الضوئية في المحلل لإثارة الفلوروفورات واكتشاف تغيرات شدة الفلورسنت. يتم حساب التغييرات في الوقت الفعلي في تركيز O2 ودرجة الحموضة تلقائيا وتظهر كمعدل استهلاك الأكسجين (OCR) ومعدل التحمض خارج الخلية (ECAR). هناك أربعة منافذ على خرطوشة المستشعر تسمح بتحميل ما يصل إلى أربعة مركبات في كل بئر أثناء قياسات الفحص. يركز هذا البروتوكول على تحديد التنفس الميتوكوندريا للفأر والعدلات البشرية ، وكذلك خلايا HL60 الشبيهة بالعدلات ، باستخدام محلل التدفق الأيضي خارج الخلية.

Protocol

تم الحصول على عينات الدم الكامل الهيبارين من متبرعين بشريين أصحاء بعد الحصول على موافقة مستنيرة ، على النحو الذي وافق عليه مجلس المراجعة المؤسسية ل UConn Health وفقا لإعلان هلسنكي. اتبعت جميع التجارب على الحيوانات إرشادات لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية لصحة UConn (IACUC) ، وتم الحصول على ال?…

Representative Results

تظهر ديناميكيات OCR التمثيلية التي تشير إلى تغيرات تنفس الميتوكوندريا استجابة لقليل الميسوميسين ، FCCP ، ومزيج روتينون / مضاد الميسين A من عدلات الفئران (الشكل 3 أ) ، والعدلات البشرية (الشكل 3 ب) ، وخلايا HL60 غير المتمايزة والمتمايزة (الشكل 3C). في ج?…

Discussion

الإجراء القياسي الذي يقيس تنفس الميتوكوندريا للعدلات باستخدام محلل التدفق الأيضي خارج الخلية محدود بالعديد من العوامل ، بما في ذلك عدد الخلايا ونمو الخلايا وقابليتها للحياة. يختلف كل تركيز مركب بين نوع ومصدر الخلايا في هذا الفحص. يستخدم Oligomycin و rotenone / antimycin A في الغالب بتركيز مماثل بين معظ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نحن نقدر الدكتور أنتوني تي فيلا والدكتورة فيديريكا أغليانوين من قسم علم المناعة في UConn Health لتدريبهما على استخدام محلل التدفق الأيضي خارج الخلية ، والدكتورة لين بودينجتون في قسم علم المناعة في UConn Health لدعمها للأدوات. نعترف بالدكتورة جنيف هارجيس من كلية الطب بجامعة كاليفورنيا في كاليفورنيا لمساعدتها في الكتابة العلمية وتحرير هذه المخطوطة. تم دعم هذا البحث بمنح من المعاهد الوطنية للصحة ، والمعهد الوطني للقلب والرئة والدم (R01HL145454) ، والمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (R35GM147713 و P20GM139763) ، وصندوق بدء التشغيل من UConn Health ، وزمالة إعادة الدخول الوظيفي من الجمعية الأمريكية لعلماء المناعة.

Materials

37 °C non-CO2 incubator Precision Economy Model 2EG Instrument
Biorender Software Application
Centrifuge Eppendorf Model 5810R Instrument
Corning Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive Corning 102416-100 Reagent
EasySep Magnet STEMCELL 18000 Magnet
EasySepMouse Neutrophil Enrichment kit STEMCELL 19762A Reagents
Graphpad Prism 9 Software Application
Human Serum Albumin Solution (25%) GeminiBio 800-120 Reagents
Ketamine (VetaKet) DAILYMED NDC 59399-114-10 Anesthetic
PBS Cytiva SH30256.01 Reagents
Plate buckets Eppendorf UL155 Accessory
PolymorphPrep PROGEN 1895 (previous 1114683) polysaccharide solution
Purified mouse anti-human CD18 antibody Biolegend 302102 Clone TS1/18
RPMI 1640 Medium Gibco 11-875-093 Reagents
Seahorse metabolic extracellular flux analyzer Agilent XFe96 Instrument
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit Agilent 103015-100 mitochondrial stress test Kit
Swing-bucket rotor Eppendorf A-4-62 Rotor
Vactrap 2 Vacum Trap Fox Lifesciences 3052101-FLS Instrument
Wave Software Application
XF 1.0 M Glucose Solution Agilent 103577-100 Reagent
XF 100 mM Pyruvate Solution Agilent 103578-100 Reagent
XF 200 mM Glutamine Solution Agilent 103579-100 Reagent
XF DMEM medium Agilent 103575-100 Reagent
XFe96 FluxPak Agilent 102601-100 Material
Xylazine (AnaSed Injection) DAILYMED NDC 59399-110-20 Anesthetic
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795 (2019).
  2. Noguchi, M., Kasahara, A. Mitochondrial dynamics coordinate cell differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 59-64 (2018).
  3. Zhu, L., et al. Correlation between mitochondrial dysfunction, cardiovascular diseases, and traditional Chinese medicine. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2020, e2902136 (2020).
  4. Kaarniranta, K., et al. Mechanisms of mitochondrial dysfunction and their impact on age-related macular degeneration. Progress in Retinal and Eye Research. 79, 100858 (2020).
  5. Onyango, I. G., Khan, S. M., Bennett, J. P. Mitochondria in the pathophysiology of Alzheimer’s and Parkinson’s diseases. Frontiers in Bioscience. 22 (5), 854-872 (2017).
  6. Loiseau, D., et al. Mitochondrial coupling defect in Charcot-Marie-Tooth type 2A disease. Annals of Neurology. 61 (4), 315-323 (2007).
  7. Zucker-Franklin, D. Electron microscopic studies of human granulocytes: structural variations related to function. Seminars in Hematology. 5 (2), 109-133 (1968).
  8. Karnovsky, M. L. The metabolism of leukocytes. Seminars in Hematology. 5 (2), 156-165 (1968).
  9. Bao, Y., et al. mTOR and differential activation of mitochondria orchestrate neutrophil chemotaxis. The Journal of Cell Biology. 210 (7), 1153-1164 (2015).
  10. Fossati, G., et al. The mitochondrial network of human neutrophils: role in chemotaxis, phagocytosis, respiratory burst activation, and commitment to apoptosis. Journal of Immunology. 170 (4), 1964-1972 (2003).
  11. Pryde, J. G., Walker, A., Rossi, A. G., Hannah, S., Haslett, C. Temperature-dependent arrest of neutrophil apoptosis. Failure of Bax insertion into mitochondria at 15 degrees C prevents the release of cytochrome c. The Journal of Biological Chemistry. 275 (43), 33574-33584 (2000).
  12. Maianski, N. A., Mul, F. P. J., van Buul, J. D., Roos, D., Kuijpers, T. W. Granulocyte colony-stimulating factor inhibits the mitochondria-dependent activation of caspase-3 in neutrophils. Blood. 99 (2), 672-679 (2002).
  13. Bao, Y., et al. Mitochondria regulate neutrophil activation by generating ATP for autocrine purinergic signaling. The Journal of Biological Chemistry. 289 (39), 26794-26803 (2014).
  14. Chouchani, E. T., et al. Ischaemic accumulation of succinate controls reperfusion injury through mitochondrial ROS. Nature. 515 (7527), 431-435 (2014).
  15. Hayashi, G., Cortopassi, G. Oxidative stress in inherited mitochondrial diseases. Free Radical Biology and Medicine. 88, 10-17 (2015).
  16. Mailloux, R. J. An update on mitochondrial reactive oxygen species production. Antioxidants. 9 (6), 472 (2020).
  17. Abuaita, B. H., et al. The IRE1α stress signaling axis is a key regulator of neutrophil antimicrobial effector function. Journal of Immunology. 207 (1), 210-220 (2021).
  18. Lood, C., et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease. Nature Medicine. 22 (2), 146-153 (2016).
  19. Douda, D. N., Khan, M. A., Grasemann, H., Palaniyar, N. SK3 channel and mitochondrial ROS mediate NADPH oxidase-independent NETosis induced by calcium influx. Proceedings of the National Academy of Sciencesa. 112 (9), 2817-2822 (2015).
  20. Monteith, A. J., et al. Altered mitochondrial homeostasis during systemic lupus erythematosus impairs neutrophil extracellular trap formation rendering neutrophils ineffective at combating Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 208 (2), 454-463 (2022).
  21. Monteith, A. J., Miller, J. M., Beavers, W. N., Juttukonda, L. J., Skaar, E. P. Increased dietary manganese impairs neutrophil extracellular trap formation rendering neutrophils ineffective at combating Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 90 (3), 0068521 (2022).
  22. Monteith, A. J., et al. Mitochondrial calcium uniporter affects neutrophil bactericidal activity during Staphylococcus aureus infection. Infection and Immunity. 90 (2), 0055121 (2022).
  23. Cao, Z., et al. Roles of mitochondria in neutrophils. Frontiers in Immunology. 13, 934444 (2022).
  24. Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. The Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
  25. Fan, Z., Ley, K. Developing neutrophils must eat…themselves. Immunity. 47 (3), 393-395 (2017).
  26. Riffelmacher, T., et al. Autophagy-dependent generation of free fatty acids is critical for normal neutrophil differentiation. Immunity. 47 (3), 466-480 (2017).
  27. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
  28. Swamydas, M., Isolation Lionakis, M. S. purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of Visualized Experiments. (77), e50586 (2013).
  29. Gerner, M. C., et al. Packed red blood cells inhibit T-cell activation via ROS-dependent signaling pathways. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100487 (2021).
  30. Zhang, Z. -. W., et al. Red blood cell extrudes nucleus and mitochondria against oxidative stress. IUBMB Life. 63 (7), 560-565 (2011).
  31. Kuhns, D. B., Priel, D. A. L., Chu, J., Zarember, K. A. Isolation and functional analysis of human neutrophils. Current Protocols in Immunology. 111, 1-16 (2015).
  32. Hearne, A., Chen, H., Monarchino, A., Wiseman, J. S. Oligomycin-induced proton uncoupling. Toxicology In Vitro. 67, 104907 (2020).
  33. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio-Protocol. 8 (10), e2850 (2018).
  34. Nath, S. The molecular mechanism of ATP synthesis by F1F0-ATP synthase: a scrutiny of the major possibilities. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 74, 65-98 (2002).
  35. Heinz, S., et al. Mechanistic investigations of the mitochondrial complex I inhibitor rotenone in the context of pharmacological and safety evaluation. Scientific Reports. 7 (1), 45465 (2017).
  36. Hytti, M., et al. Antimycin A-induced mitochondrial damage causes human RPE cell death despite activation of autophagy. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 1583656 (2019).
  37. Malecki, M., Kamrad, S., Ralser, M., Bähler, J. Mitochondrial respiration is required to provide amino acids during fermentative proliferation of fission yeast. EMBO Reports. 21 (11), e50845 (2020).
  38. Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).
  39. Marchetti, P., Fovez, Q., Germain, N., Khamari, R., Kluza, J. Mitochondrial spare respiratory capacity: Mechanisms, regulation, and significance in non-transformed and cancer cells. The FASEB Journal. 34 (10), 13106-13124 (2020).
  40. Nicholas, D., et al. Advances in the quantification of mitochondrial function in primary human immune cells through extracellular flux analysis. PLoS One. 12 (2), e0170975 (2017).
  41. Tur, J., et al. Mitofusin 2 in macrophages links mitochondrial ROS production, cytokine release, phagocytosis, autophagy, and bactericidal activity. Cell Reports. 32 (8), 108079 (2020).
  42. Benz, R., McLaughlin, S. The molecular mechanism of action of the proton ionophore FCCP (carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone). Biophysical Journal. 41 (3), 381-398 (1983).
  43. Wettmarshausen, J., Perocchi, F. Assessing calcium-stimulated mitochondrial bioenergetics using the seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1925, 197-222 (2019).
  44. Forkink, M., et al. Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (8), 1247-1256 (2014).
  45. . Methods for Reducing Cell Growth Edge Effects in Agilent Seahorse XF Cell Culture Microplates Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/user-manual-methods-for-reducing-cell-growth-edge-effect-cell-analysis-5994-0240en-agilent.pdf (2019)
  46. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  47. Wu, D., Yotnda, P. Induction and testing of hypoxia in cell culture. Journal of Visualized Experiments. (54), e2899 (2011).
  48. Normalisation of Seahorse XFe96 metabolic assaysto cell number with Hoechst stain using well-scan mode on the CLARIOstar Plus. BMG Labtech Available from: https://www.bmglabtech.com/cn/normalisation-of-seahorse-xfe96-metabolic-assays-to-cell-number-with-hoechst-stain/ (2020)
  49. Yetkin-Arik, B., et al. The role of glycolysis and mitochondrial respiration in the formation and functioning of endothelial tip cells during angiogenesis. Scientific Reports. 9 (1), 12608 (2019).
  50. Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. Mitochondrial proton and electron leaks. Essays in Biochemistry. 47, 53-67 (2010).
  51. Jandl, R. C., et al. Termination of the respiratory burst in human neutrophils. The Journal of Clinical Investigation. 61 (5), 1176-1185 (1978).
  52. Azevedo, E. P., et al. A metabolic shift toward pentose phosphate pathway is necessary for amyloid fibril- and phorbol 12-myristate 13-acetate-induced neutrophil extracellular trap (NET) formation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (36), 22174-22183 (2015).
  53. Six, E., et al. AK2 deficiency compromises the mitochondrial energy metabolism required for differentiation of human neutrophil and lymphoid lineages. Cell Death & Disease. 6 (8), e1856 (2015).
  54. Kumar, S., Dikshit, M. Metabolic insight of neutrophils in health and disease. Frontiers in Immunology. 10, 2099 (2019).
  55. Rodríguez-Espinosa, O., Rojas-Espinosa, O., Moreno-Altamirano, M. M. B., López-Villegas, E. O., Sánchez-García, F. J. Metabolic requirements for neutrophil extracellular traps formation. Immunology. 145 (2), 213-224 (2015).
  56. Invernizzi, F., et al. Microscale oxygraphy reveals OXPHOS impairment in MRC mutant cells. Mitochondrion. 12 (2), 328-335 (2012).
  57. Zenaro, E., et al. Neutrophils promote Alzheimer’s disease-like pathology and cognitive decline via LFA-1 integrin. Nature Medicine. 21 (8), 880-886 (2015).
  58. Maianski, N. A., et al. Functional characterization of mitochondria in neutrophils: a role restricted to apoptosis. Cell Death and Differentiation. 11 (2), 143-153 (2004).
  59. Bergman, O., Ben-Shachar, D. Mitochondrial oxidative phosphorylation system (OXPHOS) deficits in schizophrenia. Canadian Journal of Psychiatry. 61 (8), 457-469 (2016).
  60. Zhou, W., Qu, J., Xie, S., Sun, Y., Yao, H. Mitochondrial dysfunction in chronic respiratory diseases: implications for the pathogenesis and potential therapeutics. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 5188306 (2021).
  61. Hirano, M., Emmanuele, V., Quinzii, C. M. Emerging therapies for mitochondrial diseases. Essays in Biochemistry. 62 (3), 467-481 (2018).

Tags

Keywords: Mitochondrial RespirationNeutrophilsHL60 CellsMetabolic Extracellular Flux AnalyzerMitochondrial FunctionCell Seeding DensityAssay MediumMouse NeutrophilsHuman NeutrophilsDifferentiated HL60 CellsUndifferentiated HL60 CellsBackground Correction
check_url/cn/64971?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Pulikkot, S., Zhao, M., Fan, Z. Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils. J. Vis. Exp. (196), e64971, doi:10.3791/64971 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image