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免疫与感染

Mensuração em Tempo Real do Perfil Bioenergético Mitocondrial de Neutrófilos

Published: June 02, 2023
doi:
10.3791/64971
, ,
1Department of Immunology, School of Medicine,UConn Health, 2Arthritis and Clinical Immunology Program,Oklahoma Medical Research Foundation, 3Department of Microbiology and Immunology,University of Oklahoma Health Science Center

Summary

Descrevemos protocolos stepwise medindo a respiração mitocondrial de neutrófilos humanos e camundongos e células HL60 usando o analisador de fluxo extracelular metabólico.

Abstract

Os neutrófilos são a primeira linha de defesa e os leucócitos mais abundantes em humanos. Essas células efetoras desempenham funções como fagocitose e explosão oxidativa, e criam armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) para depuração microbiana. Novos conhecimentos sobre as atividades metabólicas dos neutrófilos desafiam o conceito inicial de que eles dependem principalmente da glicólise. A medição precisa das atividades metabólicas pode desdobrar diferentes exigências metabólicas dos neutrófilos, incluindo o ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) (também conhecido como ciclo de Krebs), fosforilação oxidativa (OXPHOS), via das pentoses fosfato (PPP) e oxidação de ácidos graxos (FAO) sob condições fisiológicas e em estados patológicos. Este artigo descreve um protocolo passo-a-passo e pré-requisitos para medir a taxa de consumo de oxigênio (OCR) como um indicador da respiração mitocondrial em neutrófilos derivados da medula óssea de camundongos, neutrófilos derivados do sangue humano e a linhagem celular HL60 semelhante a neutrófilos, usando análise de fluxo metabólico em um analisador de fluxo extracelular metabólico. Este método pode ser usado para quantificar as funções mitocondriais de neutrófilos em condições normais e de doença.

Introduction

As mitocôndrias desempenham um papel importante na bioenergética celular, que gera trifosfato de adenosina (ATP) por fosforilação oxidativa (OXPHOS). Além disso, o papel das mitocôndrias se estende à geração e desintoxicação de espécies reativas de oxigênio, regulação do cálcio da matriz citoplasmática e mitocondrial, síntese celular, catabolismo e transporte de metabólitos dentro da célula1. A respiração mitocondrial é essencial em todas as células, pois sua disfunção pode resultar em problemas metabólicos 2, incluindo doenças cardiovasculares3 e uma grande variedade de doenças neurodegenerativas, como degeneração macular relacionada à idade4, Parkinson e Alzheimer5 e doença de Charcot-Marie-Tooth2 A (CMT2A)6.

Estudos de microscopia eletrônica em neutrófilos revelaram que há relativamente poucas mitocôndrias7, e elas dependem fortemente da glicólise para sua produção de energia, uma vez que as taxas de respiração mitocondrial são muito baixas8. Entretanto, as mitocôndrias são cruciais para as funções dos neutrófilos, como quimiotaxia9 e apoptose10,11,12. Um estudo anterior revelou uma complexa rede mitocondrial em neutrófilos humanos com alto potencial de membrana. A perda do potencial de membrana mitocondrial é um indicador precoce de apoptose neutrofílica10. O tratamento com o desacoplador mitocondrial carbonil cianeto m-clorofenil hidrazona (CCCP) mostrou inibição significativa da quimiotaxia, juntamente com alteração na morfologia mitocondrial 9,10.

Embora a principal fonte de energia para os neutrófilos seja a glicólise, as mitocôndrias fornecem o ATP que inicia a ativação dos neutrófilos alimentando a primeira fase da sinalização purinérgica, que aumenta a sinalização de Ca2+, amplifica a produção de ATP mitocondrial e inicia as respostas funcionais dos neutrófilos13. A disfunção da cadeia respiratória mitocondrial resulta na produção excessiva de espécies reativas tóxicas de oxigênio (EROs) e leva a danos patogênicos14,15,16. NETosis, que é o processo de formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs), é uma propriedade crítica dos neutrófilos que os ajuda a lutar contra patógenos17 e contribui para muitas condições patológicas, incluindo câncer, trombose e doenças autoimunes18. As ERO derivadas da mitocôndria contribuem para a NETosis19, o DNA mitocondrial pode ser um componente das NETs18 e a homeostase mitocondrial alterada prejudica a NETosis 20,21,22,23,24. Além disso, durante a diferenciação ou maturação normal, a reprogramação metabólica dos neutrófilos é revertida pela limitação da atividade glicolítica, que se engaja na respiração mitocondrial e mobiliza lipídios intracelulares25,26.

O analisador de fluxo extracelular metabólico pode monitorar e quantificar continuamente a respiração mitocondrial de células vivas e a glicólise. O analisador utiliza um cartucho sensor em formato de placa de 96 poços e dois fluoróforos para quantificar a concentração de oxigênio (O2) e as mudanças de pH. O cartucho do sensor está acima da monocamada da célula durante o ensaio e forma uma microcâmara de ~200 nm de altura. Os feixes de fibras ópticas no analisador são usados para excitar os fluoróforos e detectar as mudanças de intensidade fluorescente. Mudanças em tempo real na concentração de O2 e pH são automaticamente calculadas e mostradas como taxa de consumo de oxigênio (OCR) e taxa de acidificação extracelular (ECAR). Há quatro portas no cartucho do sensor que permitem carregar até quatro compostos em cada poço durante as medições de ensaio. Este protocolo concentra-se em quantificar a respiração mitocondrial de neutrófilos humanos e camundongos, bem como as células HL60 semelhantes a neutrófilos, usando o analisador de fluxo extracelular metabólico.

Protocol

Amostras de sangue total heparinizadas foram obtidas de doadores humanos saudáveis após a obtenção do consentimento informado, conforme aprovado pelo Comitê de Revisão Institucional da UConn Health de acordo com a Declaração de Helsinque. Todos os experimentos com animais seguiram as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UConn Health (IACUC), e a aprovação para o uso de roedores foi obtida da IACUC da UConn Health de acordo com os critérios descritos no Guide for the Care and Use …

Representative Results

Dinâmica representativa de OCR é mostrada indicando as alterações da respiração mitocondrial em resposta à oligomicina, FCCP e mistura de rotenona/antimicina A de neutrófilos de camundongos (Figura 3A), neutrófilos humanos (Figura 3B) e células HL60 indiferenciadas e diferenciadas (Figura 3C). Em todas as células, o tratamento com oligomicina diminui o valor de OCR inibindo o canal de prótons da ATP sintase; O tratamento…

Discussion

O procedimento padrão que mede a respiração mitocondrial de neutrófilos usando o analisador de fluxo extracelular metabólico é limitado por muitos fatores, incluindo número celular, crescimento celular e viabilidade. Cada concentração de composto varia entre o tipo e a fonte de células neste ensaio. Oligomicina e rotenona/antimicina A são usadas principalmente em uma concentração semelhante entre a maioria dos tipos celulares. No entanto, como a frequência respiratória máxima induzida pelo FCCP varia ent…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos ao Dr. Anthony T. Vella e à Dra. Federica Aglianoin do Departamento de Imunologia da UConn Health por seu treinamento no uso do analisador de fluxo extracelular metabólico, e à Dra. Lynn Puddington no Departamento de Imunologia da UConn Health por seu apoio aos instrumentos. Agradecemos à Dra. Geneva Hargis, da UConn School of Medicine, por sua ajuda na redação científica e edição deste manuscrito. Esta pesquisa foi apoiada por subsídios dos Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional do Coração, Pulmão e Sangue (R01HL145454), Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (R35GM147713 e P20GM139763), um fundo de inicialização da UConn Health e uma bolsa de reentrada na carreira da Associação Americana de Imunologistas.

Materials

37 °C non-CO2 incubator Precision Economy Model 2EG Instrument
Biorender Software Application
Centrifuge Eppendorf Model 5810R Instrument
Corning Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive Corning 102416-100 Reagent
EasySep Magnet STEMCELL 18000 Magnet
EasySepMouse Neutrophil Enrichment kit STEMCELL 19762A Reagents
Graphpad Prism 9 Software Application
Human Serum Albumin Solution (25%) GeminiBio 800-120 Reagents
Ketamine (VetaKet) DAILYMED NDC 59399-114-10 Anesthetic
PBS Cytiva SH30256.01 Reagents
Plate buckets Eppendorf UL155 Accessory
PolymorphPrep PROGEN 1895 (previous 1114683) polysaccharide solution
Purified mouse anti-human CD18 antibody Biolegend 302102 Clone TS1/18
RPMI 1640 Medium Gibco 11-875-093 Reagents
Seahorse metabolic extracellular flux analyzer Agilent XFe96 Instrument
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit Agilent 103015-100 mitochondrial stress test Kit
Swing-bucket rotor Eppendorf A-4-62 Rotor
Vactrap 2 Vacum Trap Fox Lifesciences 3052101-FLS Instrument
Wave Software Application
XF 1.0 M Glucose Solution Agilent 103577-100 Reagent
XF 100 mM Pyruvate Solution Agilent 103578-100 Reagent
XF 200 mM Glutamine Solution Agilent 103579-100 Reagent
XF DMEM medium Agilent 103575-100 Reagent
XFe96 FluxPak Agilent 102601-100 Material
Xylazine (AnaSed Injection) DAILYMED NDC 59399-110-20 Anesthetic
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Pulikkot, S., Zhao, M., Fan, Z. Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils. J. Vis. Exp. (196), e64971, doi:10.3791/64971 (2023).
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