Eisenchlorid-induzierte arterielle Thrombose und Probenentnahme für die 3D-Elektronenmikroskopie-Analyse
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie eine FeCl3-vermittelte Verletzung verwendet werden kann, um eine arterielle Thrombose zu induzieren, und wie arterielle Verletzungsproben in verschiedenen Stadien der Thrombose für die elektronenmikroskopische Analyse gesammelt und vorbereitet werden.
Abstract
Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind weltweit eine der Hauptursachen für Mortalität und Morbidität. Aberrante Thrombosen sind ein häufiges Merkmal von systemischen Erkrankungen wie Diabetes und Fettleibigkeit sowie chronisch entzündlichen Erkrankungen wie Arteriosklerose, Krebs und Autoimmunerkrankungen. Bei einer Gefäßverletzung wirken in der Regel das Gerinnungssystem, die Blutplättchen und das Endothel orchestriert, um Blutungen zu verhindern, indem sie an der Stelle der Verletzung ein Gerinnsel bilden. Anomalien in diesem Prozess führen entweder zu übermäßigen Blutungen oder zu unkontrollierten Thrombosen/unzureichender antithrombotischer Aktivität, was sich in einem Gefäßverschluss und seinen Folgen niederschlägt. Das FeCl 3-induzierte Carotis-Verletzungsmodell ist ein wertvolles Werkzeug, um zu untersuchen, wie eine Thrombose in vivo beginnt und fortschreitet. Dieses Modell beinhaltet eine Endothelschädigung/Denudation und die anschließende Gerinnselbildung an der verletzten Stelle. Es bietet einen hochempfindlichen, quantitativen Assay zur Überwachung von Gefäßschäden und Gerinnselbildung als Reaktion auf unterschiedlich schwere Gefäßschäden. Nach der Optimierung kann diese Standardtechnik verwendet werden, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die der Thrombose zugrunde liegen, sowie die ultrastrukturellen Veränderungen der Blutplättchen in einem wachsenden Thrombus. Dieser Assay ist auch nützlich, um die Wirksamkeit von Antithrombotika und Thrombozytenaggregationshemmern zu untersuchen. In diesem Artikel wird erläutert, wie eine FeCl 3-induzierte arterielle Thrombose initiiert und überwacht wird und wie Proben für die elektronenmikroskopische Analyse entnommen werden.
Introduction
Thrombose ist die Bildung eines Blutgerinnsels, das ein Blutgefäß teilweise oder vollständig blockiert und den natürlichen Blutfluss behindert. Dies führt zu schweren und tödlichen kardiovaskulären Ereignissen wie ischämischen Herzerkrankungen und Schlaganfällen. Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind die häufigste Ursache für Morbidität und Mortalität und verursachen weltweit jeden vierten Todesfall 1,2,3. Obwohl sich eine Thrombose als Fehlfunktion des Gefäßsystems manifestiert, kann sie auf eine zugrunde liegende mikrobielle oder virale Infektion, eine Immunstörung, eine Malignität oder einen Stoffwechselzustand zurückzuführen sein. Der Blutfluss wird durch das komplexe Zusammenspiel zwischen verschiedenen Komponenten des Gefäßsystems aufrechterhalten, einschließlich Endothelzellen, roten/weißen Blutkörperchen, Blutplättchen und Gerinnungsfaktoren4. Bei einer Gefäßverletzung interagieren Blutplättchen mit adhäsiven Proteinen auf der subendothelialen Matrix und setzen ihren körnigen Inhalt frei, der mehr Blutplättchen rekrutiert5. Gleichzeitig wird die Gerinnungskaskade aktiviert, was zur Fibrinbildung und -ablagerung führt. Letztendlich wird ein Gerinnsel gebildet, das Blutplättchen und rote Blutkörperchen enthält, die in einem Fibrinnetzeingeschlossen sind 6. Obwohl Thrombozytenaggregationshemmer und Antikoagulanzien zur Modulation von Thrombosen zur Verfügung stehen, bleiben unechte Blutungen bei diesen Therapien ein großes Problem, das eine Feinabstimmung der Dosierungen und Kombinationen dieser Medikamente erfordert. Daher besteht nach wie vor ein dringender Bedarf, neue antithrombotische Medikamente zu entdecken7.
Thrombosen werden mit mehreren Methoden untersucht, um Gefäßverletzungen zuzufügen: mechanisch (Gefäßligatur), thermisch (Laserverletzung) und chemisch (FeCl3 / Rose Bengal-Anwendung). Die Art der Thrombose variiert je nach Lokalisation (arteriell vs. venös), Methode oder Ausmaß der Verletzung. Unter all diesen Typen ist die FeCl 3-induzierte Gefäßverletzung die am weitesten verbreitete Methode. Es wurde bei Mäusen, Ratten, Kaninchen, Meerschweinchen und Hundeneingesetzt 8,9,10,11,12. Die Methode ist relativ einfach, leicht anzuwenden, und wenn die wichtigsten Parameter standardisiert sind, ist sie in verschiedenen Gefäßsystemen (z. B. Arterien [Halsschlagader und Femur], Venen [Jugular] und Arteriolen [Kremaster und Mesenterium]) empfindlich und reproduzierbar (Ergänzungstabelle 1).
Dieses Modell kann auch verwendet werden, um unser Verständnis der Mechanik und Morphologie der Gerinnselbildung zu erweitern. Diese Technik bietet auf einzigartige Weise den Vorteil, die Thrombose an verschiedenen Flussratenpunkten zu stoppen, um die Zwischenstadien des Prozesses zu untersuchen, bevor er okklusiv wird. Jüngste Fortschritte in der Thromboseforschung haben dieses Modell verwendet, um die Aufmerksamkeit auf nicht-pharmakologische Methoden der Thrombolyse13 oder die nicht-invasive Verabreichung von antithrombotischen und/oder fibrinolytischen Wirkstoffen14,15 zu lenken. Mehrere Gruppen haben gezeigt, dass, wenn Thrombozytenmembranen mit diesen Therapeutika beschichtet sind, die Medikamente bei thermischer Stimulation aktiviert werden können, um auf Gerinnsel16 abzuzielen. Die hier beschriebenen Techniken können für Studien wie die Validierung ihrer Ergebnisse auf der Ebene einzelner Blutplättchen nützlich sein. In diesem Manuskript beschreibt Protokoll 1 das grundlegende FeCl 3-vermittelte Gefäßverletzungsverfahren, während Protokoll 2 die Methode zum Sammeln und Fixieren der Gefäßverletzungsprobe für die weitere Analyse durch Elektronenmikroskopie beschreibt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die topische Anwendung von FeCl3 auf das Gefäßsystem zur Induktion von Thrombosen ist eine weit verbreitete Technik und hat maßgeblich dazu beigetragen, Rollen für verschiedene Thrombozytenrezeptoren, Ligandensignalwege und ihre Inhibitorenzu etablieren 20,21,22,23. Der Mechanismus, durch den FeCl3 eine Thrombose verursacht, ist vielfältig; Früher wurde die endotheli…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken den Mitgliedern des Whiteheart Laboratory für die sorgfältige Durchsicht dieses Manuskripts. Die Arbeit wurde durch Zuschüsse des NIH, des NHLBI (HL56652, HL138179 und HL150818) sowie durch einen Verdienstpreis des Department of Veterans Affairs an S.W.W., R01 HL 155519 an BS und einen Zuschuss des NIBIB intramuralen Programms an R.D.L. unterstützt.
Materials
| 0.9% Saline | Fisher Scientific | BP358-212 | NaCl used to make a solution of 0.9% saline |
| 1 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309659 | |
| 190 Proof Ethanol | KOPTEC | V1101 | Used to make a 70% ethanol solution to use for prepping the mouse for surgery |
| 2,2,2 Tribromoethanol | Sigma Aldrich | 48402 | |
| 25 Yard Black Braided Silk Suture (5-0) | DEKNATEL | 136082-1204 | |
| 26G x 3/8 Needle | Becton, Dickinson and Company | 305110 | |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma Aldrich | 240486 | |
| 7.5 mL Transfer Pipet, Graduated to 3 mL | Globe Scientific Inc. | 135010 | |
| Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol) | Medline | MDS090735 | |
| Araldite GY 502 | Electron microscopy Services | 10900 | |
| Cell Culture Dish 35mm X 10mm | Corning Incorporated | 430165 | |
| Compact Scale | Ward's Science | 470314-390 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm long | World Precision Instrument | 15922-G | |
| DMP-30 activator | Electron microscopy Services | 13600 | |
| Dodenyl Succinic Anhydride/ DDSA | Electron microscopy Services | 13700 | |
| Doggy Poo Bags/animal carcass disposal bag | Crown Products | PP-RB-200 | |
| Doppler FlowProbe | Transonic Systems Inc. | MA0.5PSB | |
| EMBED 812 resin | Electron microscopy Services | 14900 | |
| Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof | Electron microscopy Services | 15055 | |
| Eye Dressing Forceps, 4" Full Curved, Standard, 0.8mm Wide Tips | Integra Miltex | 18-784 | |
| Filter Paper | VWR | 28310-106 | |
| Fine Scissors – Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Finger Loop Ear Punches | Fine Science Tools | 24212-01 | |
| Gauze Sponges 2” x 2” – 12 Ply | Dukal Corporation | 2128 | |
| Glutaraldehyde (10% solution) | Electron microscopy Services | 16120 | |
| Integra Miltex Carbon Steel Surgical Blade #10 | Integra® Miltex® | 4110 | |
| Iron (III) Chloride | SIGMA-ALDRICH | 157740-100G | |
| Knife Handle Miltex® Extra Fine Stainless Steel Size 3 | Integra Lifesciences | 157510 | |
| L-aspartic acid | Sigma Fisher | A93100 | |
| L-aspartic acid | Fisher Scientific | BP374-100 | |
| Lead Nitrate | Fisher Scientific | L-62 | |
| LEICA S8AP0 Microscope | LEICA | No longer available | No longer available from the company |
| LEICA S8AP0 Microscope Stand | LEICA | 10447255 | No longer available from the company |
| Light-Duty Tissue Wipers | VWR | 82003-822 | |
| Micro Dissecting Forceps; 1×2 Teeth, Full Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical Instrument Company | RS-5157 | |
| Osmium Tetroxide 4% aqueous solution | Electron microscopy Services | 19150 | |
| Paraformaldehyde (16% solution) | Electron microscopy Services | 15710 | |
| Potassium ferricyanide | SIGMA-ALDRICH | P-8131 | |
| Propylene Oxide, ACS reagent | Electron microscopy Services | 20401 | |
| Rainin Classic Pipette PR-10 | Rainin | 17008649 | |
| Research Flowmeter | Transonic Systems Inc. | T402B01481 | Model: T402 |
| Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000", Clear | Scotch | 305289 | |
| Small Animal Heated Pad | K&H Manufacturing Inc. | Model: HM10 | |
| Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH7.4 | Electron microscopy Services | 11623 | |
| Sterile Cotton Tipped Applicators | Puritan Medical Products | 25-806 1WC | |
| Steromaster Illuminator | Fisher Scientific | 12-562-21 | No longer available from the company |
| Surgical Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | SIGMA-ALDRICH | 88535 | |
| Universal Low Retention Pipet Tip Reloads (0.1-10 µL) | VWR | 76323-394 | |
| Uranyl Acetate | Electron microscopy Services | 22400 | |
| Veet Gel Cream Hair Remover | Reckitt Benckiser | 3116875 | |
| White Antistatic Hexagonal Weigh Boats, Medium, 64 x 15 x 19 mm | Fisher Scientific | S38975 | |
| WinDAQ/100 Software for Windows | DATAQ Instruments, Inc. | Version 3.38 | Freely available to download. https://www.dataq.com/products/windaq/ |
| ZEISS AxioCam Icc 1 | ZEISS | 57615 |
References
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