Ferrik Klorür Kaynaklı Arteriyel Tromboz ve 3D Elektron Mikroskobu Analizi için Numune Toplama
Summary
Bu protokol, arteriyel trombozu indüklemek için FeCl3 aracılı bir yaralanmanın nasıl kullanılacağını ve elektron mikroskobu analizi için trombozun çeşitli aşamalarında arteriyel yaralanma örneklerinin nasıl toplanacağını ve hazırlanacağını açıklamaktadır.
Abstract
Kardiyovasküler hastalıklar tüm dünyada mortalite ve morbiditenin önde gelen nedenlerinden biridir. Anormal tromboz, diyabet ve obezite gibi sistemik durumların ve ateroskleroz, kanser ve otoimmün hastalıklar gibi kronik inflamatuar hastalıkların ortak bir özelliğidir. Vasküler yaralanma üzerine, genellikle pıhtılaşma sistemi, trombositler ve endotel, yaralanma bölgesinde bir pıhtı oluşturarak kanamayı önlemek için düzenlenmiş bir şekilde hareket eder. Bu süreçteki anormallikler ya aşırı kanamaya ya da kontrolsüz tromboza / yetersiz antitrombotik aktiviteye yol açar, bu da damar tıkanıklığına ve sekellerine dönüşür. FeCl3 ile indüklenen karotis hasar modeli, trombozun in vivo olarak nasıl başladığını ve ilerlediğini araştırmak için değerli bir araçtır. Bu model endotel hasarı/denudasyonu ve ardından yaralanan bölgede pıhtı oluşumunu içerir. Farklı derecelerde vasküler hasara yanıt olarak vasküler hasarı ve pıhtı oluşumunu izlemek için oldukça hassas, kantitatif bir tahlil sağlar. Optimize edildikten sonra, bu standart teknik, trombozun altında yatan moleküler mekanizmaları ve ayrıca büyüyen bir trombüsteki trombositlerdeki ultrayapısal değişiklikleri incelemek için kullanılabilir. Bu tahlil aynı zamanda antitrombotik ve antiplatelet ajanların etkinliğini incelemek için de yararlıdır. Bu makalede, FeCl3 ile indüklenen arteriyel trombozun nasıl başlatılacağı ve izleneceği ve elektron mikroskobu ile analiz için örneklerin nasıl toplanacağı açıklanmaktadır.
Introduction
Tromboz, bir kan damarını kısmen veya tamamen bloke eden ve kanın doğal akışını engelleyen bir kan pıhtısı oluşumudur. Bu, iskemik kalp hastalığı ve felç gibi ciddi ve ölümcül kardiyovasküler olaylara yol açar. Kardiyovasküler hastalıklar morbidite ve mortalitenin önde gelen nedenidir ve dünya çapında her dört ölümden birine neden olmaktadır 1,2,3. Tromboz, vasküler sistemin bir arızası olarak ortaya çıkmasına rağmen, altta yatan bir mikrobiyal veya viral enfeksiyon, bağışıklık bozukluğu, malignite veya metabolik durumun bir sonucu olabilir. Kan akışı, endotel hücreleri, kırmızı / beyaz kan hücreleri, trombositler ve pıhtılaşma faktörleri4 dahil olmak üzere vasküler sistemin çeşitli bileşenleri arasındaki karmaşık etkileşim ile korunur. Vasküler yaralanma üzerine, trombositler subendotelyal matriks üzerindeki yapışkan proteinlerle etkileşime girer ve granüler içeriklerini serbest bırakır, bu da daha fazla trombosit alır5. Aynı zamanda, pıhtılaşma kaskadı aktive edilir ve fibrin oluşumuna ve birikmesine yol açar. Sonuçta, bir fibrin ağı6 içinde sıkışmış trombositler ve kırmızı kan hücreleri içeren bir pıhtı oluşur. Trombozu modüle etmek için antiplatelet ve antikoagülan ilaçlar mevcut olmasına rağmen, sahte kanama bu tedavilerde önemli bir endişe kaynağı olmaya devam etmekte ve bu ilaçların dozajlarının ve kombinasyonlarının ince ayarlanmasını gerektirmektedir. Bu nedenle, yeni anti-trombotik ilaçların keşfedilmesi için hala acil bir ihtiyaç vardır7.
Tromboz, vasküler yaralanmaya neden olmak için birden fazla yöntem kullanılarak incelenir: mekanik (damar ligasyonu), termal (lazer yaralanması) ve kimyasal yaralanma (FeCl3 / Rose Bengal uygulaması). Trombozun doğası, yaralanmanın lokalizasyonuna (arteriyel ve venöz), yönteme veya derecesine bağlı olarak değişir. Tüm bu tipler arasında FeCl3’e bağlı vasküler yaralanma en yaygın kullanılan yöntemdir. Farelerde, sıçanlarda, tavşanlarda, kobaylarda ve köpeklerde kullanılmıştır 8,9,10,11,12. Yöntem nispeten basittir, kullanımı kolaydır ve ana parametreler standartlaştırılırsa, çeşitli vasküler sistemlerde (örneğin, arterler [karotis ve femoral], damarlar [juguler] ve arterioller [cremaster ve mezenterik]) duyarlı ve tekrarlanabilirdir (Ek Tablo 1).
Bu model, pıhtı oluşumunun mekaniği ve morfolojisi hakkındaki anlayışımızı ilerletmek için de kullanılabilir. Bu teknik, trombozu çeşitli akış hızı noktalarında durdurma avantajını, işlemin tıkanmadan önce ara aşamalarını incelemek için benzersiz bir şekilde sunar. Tromboz araştırmalarındaki son gelişmeler, bu modeli tromboliz13’ün farmakolojik olmayan yöntemlerine veya anti-trombotik ve / veya fibrinolitik ajanların non-invaziv olarak verilmesine odaklanmak için kullanmıştır14,15. Birkaç grup, trombosit membranları bu terapötiklerle kaplandığında, ilaçların pıhtıları hedeflemek için termal stimülasyon üzerine aktive edilebileceğini göstermiştir16. Burada açıklanan teknikler, bulgularının tek trombosit düzeyinde doğrulanması gibi çalışmalar için yararlı olabilir. Bu makalede, Protokol 1 temel FeCl3 aracılı vasküler yaralanma prosedürünü tanımlarken, Protokol 2 elektron mikroskobu ile daha fazla analiz için vasküler yaralanma örneğini toplama ve düzeltme yöntemini açıklamaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
FeCl3’ün trombozu indüklemek için vaskülatüre topikal olarak uygulanması yaygın olarak kullanılan bir tekniktir ve çeşitli trombosit reseptörleri, ligand sinyal yolları ve bunların inhibitörleri20,21,22,23 için roller belirlemede etkili olmuştur. FeCl3’ün tromboza neden olduğu mekanizma çok yönlüdür; Önceden, endotel denudasyonu trombozun bir nedeni …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Whiteheart Laboratuvarı üyelerine bu makaleyi dikkatli bir şekilde inceledikleri için teşekkür eder. Çalışma, NIH, NHLBI (HL56652, HL138179 ve HL150818) hibeleri ve S.W.W.’ye Gazi İşleri Bakanlığı Liyakat Ödülü, B.S.’ye R01 HL 155519 ve R.D.L.’ye NIBIB intramural program hibesi ile desteklenmiştir.
Materials
| 0.9% Saline | Fisher Scientific | BP358-212 | NaCl used to make a solution of 0.9% saline |
| 1 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309659 | |
| 190 Proof Ethanol | KOPTEC | V1101 | Used to make a 70% ethanol solution to use for prepping the mouse for surgery |
| 2,2,2 Tribromoethanol | Sigma Aldrich | 48402 | |
| 25 Yard Black Braided Silk Suture (5-0) | DEKNATEL | 136082-1204 | |
| 26G x 3/8 Needle | Becton, Dickinson and Company | 305110 | |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma Aldrich | 240486 | |
| 7.5 mL Transfer Pipet, Graduated to 3 mL | Globe Scientific Inc. | 135010 | |
| Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol) | Medline | MDS090735 | |
| Araldite GY 502 | Electron microscopy Services | 10900 | |
| Cell Culture Dish 35mm X 10mm | Corning Incorporated | 430165 | |
| Compact Scale | Ward's Science | 470314-390 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm long | World Precision Instrument | 15922-G | |
| DMP-30 activator | Electron microscopy Services | 13600 | |
| Dodenyl Succinic Anhydride/ DDSA | Electron microscopy Services | 13700 | |
| Doggy Poo Bags/animal carcass disposal bag | Crown Products | PP-RB-200 | |
| Doppler FlowProbe | Transonic Systems Inc. | MA0.5PSB | |
| EMBED 812 resin | Electron microscopy Services | 14900 | |
| Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof | Electron microscopy Services | 15055 | |
| Eye Dressing Forceps, 4" Full Curved, Standard, 0.8mm Wide Tips | Integra Miltex | 18-784 | |
| Filter Paper | VWR | 28310-106 | |
| Fine Scissors – Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Finger Loop Ear Punches | Fine Science Tools | 24212-01 | |
| Gauze Sponges 2” x 2” – 12 Ply | Dukal Corporation | 2128 | |
| Glutaraldehyde (10% solution) | Electron microscopy Services | 16120 | |
| Integra Miltex Carbon Steel Surgical Blade #10 | Integra® Miltex® | 4110 | |
| Iron (III) Chloride | SIGMA-ALDRICH | 157740-100G | |
| Knife Handle Miltex® Extra Fine Stainless Steel Size 3 | Integra Lifesciences | 157510 | |
| L-aspartic acid | Sigma Fisher | A93100 | |
| L-aspartic acid | Fisher Scientific | BP374-100 | |
| Lead Nitrate | Fisher Scientific | L-62 | |
| LEICA S8AP0 Microscope | LEICA | No longer available | No longer available from the company |
| LEICA S8AP0 Microscope Stand | LEICA | 10447255 | No longer available from the company |
| Light-Duty Tissue Wipers | VWR | 82003-822 | |
| Micro Dissecting Forceps; 1×2 Teeth, Full Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical Instrument Company | RS-5157 | |
| Osmium Tetroxide 4% aqueous solution | Electron microscopy Services | 19150 | |
| Paraformaldehyde (16% solution) | Electron microscopy Services | 15710 | |
| Potassium ferricyanide | SIGMA-ALDRICH | P-8131 | |
| Propylene Oxide, ACS reagent | Electron microscopy Services | 20401 | |
| Rainin Classic Pipette PR-10 | Rainin | 17008649 | |
| Research Flowmeter | Transonic Systems Inc. | T402B01481 | Model: T402 |
| Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000", Clear | Scotch | 305289 | |
| Small Animal Heated Pad | K&H Manufacturing Inc. | Model: HM10 | |
| Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH7.4 | Electron microscopy Services | 11623 | |
| Sterile Cotton Tipped Applicators | Puritan Medical Products | 25-806 1WC | |
| Steromaster Illuminator | Fisher Scientific | 12-562-21 | No longer available from the company |
| Surgical Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | SIGMA-ALDRICH | 88535 | |
| Universal Low Retention Pipet Tip Reloads (0.1-10 µL) | VWR | 76323-394 | |
| Uranyl Acetate | Electron microscopy Services | 22400 | |
| Veet Gel Cream Hair Remover | Reckitt Benckiser | 3116875 | |
| White Antistatic Hexagonal Weigh Boats, Medium, 64 x 15 x 19 mm | Fisher Scientific | S38975 | |
| WinDAQ/100 Software for Windows | DATAQ Instruments, Inc. | Version 3.38 | Freely available to download. https://www.dataq.com/products/windaq/ |
| ZEISS AxioCam Icc 1 | ZEISS | 57615 |
References
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
- Raskob, G. E., et al. Thrombosis: a major contributor to global disease burden. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (11), 2363-2371 (2014).
- Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
- Palta, S., Saroa, R., Palta, A. Overview of the coagulation system. Indian Journal of Anaesthesia. 58 (5), 515-523 (2014).
- Joshi, S., Whiteheart, S. W. The nuts and bolts of the platelet release reaction. Platelets. 28 (2), 129-137 (2017).
- Periayah, M. H., Halim, A. S., Mat Saad, A. Z. Mechanism action of platelets and crucial blood coagulation pathways in hemostasis. International Journal of Hematology-Oncology and Stem Cell Research. 11 (4), 319-327 (2017).
- Alexopoulos, D., Katogiannis, K., Sfantou, D., Lekakis, J. Combination antiplatelet treatment in coronary artery disease patients: A necessary evil or an overzealous practice. Platelets. 29 (3), 228-237 (2018).
- Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thrombosis Research. 60 (4), 269-280 (1990).
- Denis, C. V., et al. Towards standardization of in vivo thrombosis studies in mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (8), 1641-1644 (2011).
- Marsh Lyle, E., et al. Assessment of thrombin inhibitor efficacy in a novel rabbit model of simultaneous arterial and venous thrombosis. Thrombosis and Haemostasis. 79 (3), 656-662 (1998).
- Kato, Y., et al. Inhibition of arterial thrombosis by a protease-activated receptor 1 antagonist, FR171113, in the guinea pig. European Journal of Pharmacology. 473 (2-3), 163-169 (2003).
- Huttinger, A. L., et al. Ferric chloride-induced canine carotid artery thrombosis: a large animal model of vascular injury. Journal of Visualized Experiments. (139), e57981 (2018).
- Zhang, W., et al. Antithrombotic therapy by regulating the ROS-mediated thrombosis microenvironment and specific nonpharmaceutical thrombolysis Using Prussian blue nanodroplets. Small. 18 (15), 2106252 (2022).
- Liu, B., et al. Platelet membrane cloaked nanotubes to accelerate thrombolysis by thrombus clot-targeting and penetration. Small. , 2205260 (2022).
- Refaat, A., et al. Near-infrared light-responsive liposomes for protein delivery: Towards bleeding-free photothermally-assisted thrombolysis. Journal of Controlled Release. 337, 212-223 (2021).
- Li, S., et al. Biomimetic nanoplatelets to target delivery hirudin for site-specific photothermal/photodynamic thrombolysis and preventing venous thrombus formation. Small. 18 (51), 2203184 (2022).
- Subramaniam, S., Kanse, S. M. Ferric chloride-induced arterial thrombosis in mice. Current Protocols in Mouse Biology. 4 (4), 151-164 (2014).
- Cocchiaro, J. L., Kumar, Y., Fischer, E. R., Hackstadt, T., Valdivia, R. H. Cytoplasmic lipid droplets are translocated into the lumen of the Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuole. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (27), 9379-9384 (2008).
- Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric-estimation from incomplete observations. Journal of the American Statistical Association. 53 (282), 457-481 (1958).
- Chauhan, A. K., Kisucka, J., Lamb, C. B., Bergmeier, W., Wagner, D. D. von Willebrand factor and factor VIII are independently required to form stable occlusive thrombi in injured veins. Blood. 109 (6), 2424-2429 (2007).
- Andre, P., et al. CD40L stabilizes arterial thrombi by a beta3 integrin–dependent mechanism. Nature Medicine. 8 (3), 247-252 (2002).
- Ni, H., et al. Persistence of platelet thrombus formation in arterioles of mice lacking both von Willebrand factor and fibrinogen. Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 385-392 (2000).
- Bergmeier, W., et al. The role of platelet adhesion receptor GPIbalpha far exceeds that of its main ligand, von Willebrand factor, in arterial thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (45), 16900-16905 (2006).
- Ciciliano, J. C., et al. Resolving the multifaceted mechanisms of the ferric chloride thrombosis model using an interdisciplinary microfluidic approach. Blood. 126 (6), 817-824 (2015).
- Eckly, A., et al. Mechanisms underlying FeCl3-induced arterial thrombosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (4), 779-789 (2011).
- Woollard, K. J., Sturgeon, S., Chin-Dusting, J. P. F., Salem, H. H., Jackson, S. P. Erythrocyte hemolysis and hemoglobin oxidation promote ferric chloride-induced vascular injury. Journal of Biological Chemistry. 284 (19), 13110-13118 (2009).
- Shim, Y., et al. Characterization of ferric chloride-induced arterial thrombosis model of mice and the role of red blood cells in thrombosis acceleration. Yonsei Medical Journal. 62 (11), 1032-1041 (2021).
- Ghosh, S., et al. Evaluation of the prothrombotic potential of four-factor prothrombin complex concentrate (4F-PCC) in animal models. PLoS One. 16 (10), 0258192 (2021).
- Wilbs, J., et al. Cyclic peptide FXII inhibitor provides safe anticoagulation in a thrombosis model and in artificial lungs. Nature Communications. 11 (1), 3890 (2020).
- Wei, Y., Deng, X., Sheng, G., Guo, X. B. A rabbit model of cerebral venous sinus thrombosis established by ferric chloride and thrombin injection. Neuroscience Letters. 662, 205-212 (2018).
- Jacob-Ferreira, A. L., et al. Antithrombotic activity of Batroxase, a metalloprotease from Bothrops atrox venom, in a model of venous thrombosis. International Journal of Biological Macromolecules. 95, 263-267 (2017).
- Zhou, X., et al. A rabbit model of cerebral microembolic signals for translational research: preclinical validation for aspirin and clopidogrel. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (9), 1855-1866 (2016).
- Yang, X., et al. Effect of evodiamine on collagen-induced platelet activation and thrombosis. BioMed Research International. 2022, 4893859 (2022).
- Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biology. 1 (1), 50-55 (2013).
- Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. Ferric chloride-induced murine thrombosis models. Journal of Visualized Experiments. (115), e54479 (2016).
- Holly, S. P., et al. Ether lipid metabolism by AADACL1 regulates platelet function and thrombosis. Blood Advances. 3 (22), 3818-3828 (2019).
- Bird, J. E., et al. Prediction of the therapeutic index of marketed anti-coagulants and anti-platelet agents by guinea pig models of thrombosis and hemostasis. Thrombosis Research. 123 (1), 146-158 (2008).
