Évaluation des niveaux d’autophagie dans deux modèles de cellules pancréatiques différents à l’aide de l’immunofluorescence LC3
Summary
L’objectif de ce protocole est de déterminer les niveaux autophagiques dans le cancer du pancréas et les cellules acineuses pancréatiques par immunofluorescence CL3 et quantification des points CL3.
Abstract
L’autophagie est un processus catabolique spécialisé qui dégrade sélectivement les composants cytoplasmiques, y compris les protéines et les organites endommagés. L’autophagie permet aux cellules de répondre physiologiquement aux stimuli de stress et, ainsi, de maintenir l’homéostasie cellulaire. Les cellules cancéreuses peuvent moduler leurs niveaux d’autophagie pour s’adapter à des conditions défavorables telles que l’hypoxie, une carence en nutriments ou des dommages causés par la chimiothérapie. L’adénocarcinome pancréatique canalaire est l’un des types de cancer les plus mortels. Les cellules cancéreuses du pancréas ont une activité d’autophagie élevée en raison de la régulation transcriptionnelle à la hausse et de l’activation post-traductionnelle des protéines d’autophagie.
Ici, la lignée cellulaire PANC-1 a été utilisée comme modèle de cellules cancéreuses humaines pancréatiques, et la lignée cellulaire acineuse pancréatique AR42J a été utilisée comme modèle physiologique de cellules de mammifères hautement différenciées. Cette étude a utilisé l’immunofluorescence de la chaîne légère 3 (CL3) de la protéine associée aux microtubules comme indicateur de l’état de l’activation de l’autophagie. LC3 est une protéine d’autophagie qui, dans des conditions basales, présente un schéma diffus de distribution dans le cytoplasme (connu sous le nom de LC3-I dans cette condition). L’induction de l’autophagie déclenche la conjugaison de la CL3 à la phosphatidyléthanolamine à la surface des autophagosomes nouvellement formés pour former la LC3-II, une protéine liée à la membrane qui aide à la formation et à l’expansion des autophagosomes. Pour quantifier le nombre de structures autophagiques étiquetées, le logiciel open source FIJI a été utilisé à l’aide de l’outil « 3D Objects Counter ».
La mesure des niveaux autophagiques à la fois dans les conditions physiologiques et dans les cellules cancéreuses nous permet d’étudier la modulation de l’autophagie dans diverses conditions telles que l’hypoxie, le traitement de chimiothérapie ou l’élimination de certaines protéines.
Introduction
La macroautophagie (communément appelée autophagie) est un processus catabolique spécialisé qui dégrade sélectivement les composants cytoplasmiques, y compris les protéines et les organites endommagés 1,2. L’autophagie permet aux cellules de répondre physiologiquement aux stimuli de stress et, ainsi, de maintenir l’homéostasie cellulaire3. Au cours de l’autophagie, une vésicule à double membrane se forme : l’autophagosome. L’autophagosome contient les molécules de cargaison et les conduit au lysosome pour la dégradation 1,4.
Les autophagosomes sont décorés par la chaîne légère 3 (CL3)5 de la protéine autophagique associée aux microtubules. Lorsque l’autophagie n’est pas induite, la CL3 est diffusée dans le cytoplasme et le noyau dans la conformation LC3-I. En revanche, lorsque l’autophagie est induite, la CL3 est conjuguée à une phosphatidyléthanolamine dans la membrane des structures autophagiques6. Cette nouvelle conformation LC3 est connue sous le nom de LC3-II1. Le décalage de conformation de la CL3 provoque des changements dans sa localisation cellulaire et sa migration par électrophorèse sur gel de sulfate de sodium dodécyle-polyacrylamide (SDS-PAGE), qui peuvent être détectées par des techniques telles que l’immunofluorescence et le Western blot 5,7. De cette façon, la conjugaison de la CL3 est un événement clé dans le processus autophagique qui peut être utilisé pour mesurer l’activité autophagique.
La cellule acineuse pancréatique est une cellule hautement différenciée qui, dans des conditions saines, a un faible taux d’autophagie. Cependant, dans différentes conditions physiologiques ou sous stimulation pharmacologique, ils peuvent activer l’autophagie. Par conséquent, la détermination des niveaux autophagiques dans cette lignée cellulaire est utile pour étudier les effets directs ou indirects potentiels de différents agents pharmacologiques ou biologiques sur l’autophagie 8,9.
L’adénocarcinome pancréatique canalaire est l’un des types de cancer les plus mortels, compte tenu de son diagnostic tardif et de sa résistance élevée à la chimiothérapie10. Les cellules cancéreuses du pancréas ont une activité d’autophagie élevée en raison de la régulation transcriptionnelle positive et de l’activation post-traductionnelle des protéines liées à l’autophagie11. Les cellules cancéreuses du pancréas peuvent ajuster leurs niveaux d’autophagie en réponse à des conditions défavorables telles que l’hypoxie, la privation de nutriments ou les dommages induits par la chimiothérapie11. Par conséquent, l’analyse des niveaux d’autophagie dans les cellules cancéreuses du pancréas peut aider à comprendre comment elles s’adaptent à divers environnements et à évaluer l’efficacité des traitements modulateurs de l’autophagie.
Cette étude montre une méthode pour effectuer l’immunofluorescence LC3 dans deux modèles cellulaires pancréatiques distincts. Le premier modèle, les cellules PANC-1, a servi de modèle pour l’adénocarcinome canalaire pancréatique. Ces cellules ont été traitées avec de la gemcitabine, un agent de chimiothérapie dont il a déjà été démontré qu’il induisait l’autophagie, en particulier dans les cellules cancéreuses du pancréas porteuses du gène oncogène du virus du sarcome du rat de Kirsten (KRAS)12,13. Le deuxième modèle, les cellules AR42J, a servi de modèle plus physiologique des cellules pancréatiques exocrines. Ces cellules ont été différenciées avec la dexaméthasone pour devenir plus semblables aux cellules pancréatiques acineuses14. Dans ces cellules, l’autophagie a été induite pharmacologiquement par l’utilisation de PP242, qui est un puissant inhibiteur de mTOR15. Dans cette étude, nous démontrons l’applicabilité du protocole décrit avec deux modèles pancréatiques différents et sa capacité à discriminer entre les états d’autophagie basse et élevée.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode décrite dans ce protocole permet de visualiser la distribution endogène de la CL3 dans la cellule et de quantifier les niveaux autophagiques dans différentes conditions. Une autre méthode similaire utilisée pour analyser la distribution de la CL3 et déterminer l’activation de l’autophagie implique la transfection de CL3 marquée par fluorescence (telle que RFP-LC3)19. La transfection RFP-LC3 présente l’avantage de ne pas avoir besoin de fixation (ce qui permet d’applique…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions de l’Université de Buenos Aires (UBACyT 2018-2020 20020170100082BA), du Conseil national pour la recherche scientifique et la technologie (CONICET) (PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO; et PUE 22920170100033) et de l’Agence nationale pour la promotion scientifique et technologique (PICT 2019-01664).
Materials
| 10x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 46-013-CM | |
| 12 mm round coverslips | HDA | CBR_OBJ_6467 | |
| 24 Well- Cell Culture Plate | Sorfa | 220300 | |
| Absolute ethanol | Biopack | 2207.10.00 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | R37119 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | Invitrogen | 62248 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | |
| DMEN | Sartorius | 01-052-1A | |
| Fetal Bovine Serum | NATOCOR | Lintc-634 | |
| Gemcitabina | Eli Lilly | VL7502 | |
| LC3B (D11) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 3868S | |
| Methanol | Anedra | 6197 | |
| Parafilm "M" (Laboratory Sealing Film) | Bemis/Curwood | PM-996 | |
| Pen-Strep Solution | Sartorius | 03-031-1B | |
| PP242 | Santa Cruz Biotechnology | SC-301606 | |
| Trypsin EDTA | Gibco | 11570626 |
References
- Grasso, D., Renna, F. J., Vaccaro, M. I. Initial steps in mammalian autophagosome biogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 146 (2018).
- Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of autophagy and related processes. EMBO Journal. 36 (13), 1811-1836 (2017).
- Kitada, M., Koya, D. Autophagy in metabolic disease and ageing. Nature Reviews Endocrinology. 17 (11), 647-661 (2021).
- Ktistakis, N. T., Tooze, S. A. Digesting the expanding mechanisms of autophagy. Trends in Cell Biology. 26 (8), 624-635 (2016).
- Tanida, I., Ueno, T., Kominami, E. LC3 and autophagy. Methods in Molecular Biology. 445, 77-88 (2008).
- Kabeya, Y., et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO Journal. 19 (21), 5720-5728 (2000).
- Mizushima, N., Yoshimori, T. How to interpret LC3 immunoblotting. Autophagy. 3 (6), 542-545 (2007).
- Vanasco, V., et al. Mitochondrial dynamics and VMP1-related selective mitophagy in experimental acute pancreatitis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 640094 (2021).
- Williams, J. A. Regulatory mechanisms in pancreas and salivary acini. Annual Review of Physiology. 46, 361-375 (1984).
- Mizrahi, J. D., Surana, R., Valle, J. W., Shroff, R. T. Pancreatic cancer. Lancet. 395 (10242), 2008-2020 (2020).
- Li, J., et al. Regulation and function of autophagy in pancreatic cancer. Autophagy. 17 (11), 3275-3296 (2021).
- Ropolo, A., et al. A novel E2F1-EP300-VMP1 pathway mediates gemcitabine-induced autophagy in pancreatic cancer cells carrying oncogenic KRAS. Frontiers in Endocrinology. 11, 411 (2020).
- Pardo, R., et al. Gemcitabine induces the VMP1-mediated autophagy pathway to promote apoptotic death in human pancreatic cancer cells. Pancreatology. 10 (1), 19-26 (2010).
- Logsdon, C. D., Moessner, J., Williams, J. A., Goldfine, I. D. Glucocorticoids increase amylase mRNA levels, secretory organelles, and secretion in pancreatic acinar AR42J cells. Journal of Cell Biology. 100 (4), 1200-1208 (1985).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 17 (1), 1 (2021).
- Segeritz, C. -. P., Vallier, L., Jalali, M., Saldanha, F. Y. L., Jalali, M. Chapter 9 – Cell culture: Growing cells as model systems in vitro. Basic Science Methods for Clinical Researchers. , 151-172 (2017).
- Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
- Grasso, D., et al. a novel selective autophagy pathway mediated by VMP1-USP9x-p62, prevents pancreatic cell death. Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 8308-8324 (2011).
- Ropolo, A., et al. The pancreatitis-induced vacuole membrane protein 1 triggers autophagy in mammalian cells. Journal of Biological Chemistry. 282 (51), 37124-37133 (2007).
- Karanasios, E., Stapleton, E., Walker, S. A., Manifava, M., Ktistakis, N. T. Live cell imaging of early autophagy events: Omegasomes and beyond. Journal of Visualized Experiments. (77), e50484 (2013).
- Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization. Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).
- Zhang, Z., Singh, R., Aschner, M. Methods for the detection of autophagy in mammalian cells. Current Protocols in Toxicology. 69, 1-26 (2016).
- Yoshii, S. R., Mizushima, N. Monitoring and measuring autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1865 (2017).
- Betriu, N., Andreeva, A., Semino, C. E. Erlotinib promotes ligand-induced EGFR degradation in 3D but not 2D cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma cells. Cancers. 13 (18), 4504 (2021).
- Wang, W., Dong, L., Zhao, B., Lu, J., Zhao, Y. E-cadherin is downregulated by microenvironmental changes in pancreatic cancer and induces EMT. Oncology Reports. 40 (3), 1641-1649 (2018).
- Kim, S. K., et al. Phenotypic heterogeneity and plasticity of cancer cell migration in a pancreatic tumor three-dimensional culture model. Cancers. 12 (5), 1305 (2020).
- Meng, Y., et al. Cytoplasmic EpCAM over-expression is associated with favorable clinical outcomes in pancreatic cancer patients with Hepatitis B virus negative infection. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (12), 22204-22216 (2015).
- Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor. Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).
