Evaluación de los niveles de autofagia en dos modelos diferentes de células pancreáticas utilizando inmunofluorescencia LC3
Summary
El objetivo de este protocolo es determinar los niveles autofágicos en el cáncer de páncreas y las células acinares pancreáticas a través de la inmunofluorescencia LC3 y la cuantificación de puntos LC3.
Abstract
La autofagia es un proceso catabólico especializado que degrada selectivamente los componentes citoplasmáticos, incluidas las proteínas y los orgánulos dañados. La autofagia permite a las células responder fisiológicamente a los estímulos de estrés y, por lo tanto, mantener la homeostasis celular. Las células cancerosas pueden modular sus niveles de autofagia para adaptarse a condiciones adversas como hipoxia, deficiencia de nutrientes o daño causado por la quimioterapia. El adenocarcinoma pancreático ductal es uno de los tipos de cáncer más mortales. Las células de cáncer de páncreas tienen una alta actividad de autofagia debido a la regulación transcripcional positiva y la activación postraduccional de las proteínas de autofagia.
Aquí, la línea celular PANC-1 se utilizó como modelo de células de cáncer de páncreas humano, y la línea celular acinar pancreática AR42J se utilizó como modelo fisiológico de células de mamíferos altamente diferenciadas. Este estudio utilizó la inmunofluorescencia de la cadena ligera 3 de la proteína asociada a microtúbulos (CL3) como un indicador del estado de activación de la autofagia. La CL3 es una proteína de autofagia que, en condiciones basales, muestra un patrón difuso de distribución en el citoplasma (conocido como LC3-I en esta condición). La inducción de autofagia desencadena la conjugación de CL3 a fosfatidiletanolamina en la superficie de los autofagosomas recién formados para formar LC3-II, una proteína unida a la membrana que ayuda en la formación y expansión de autofagosomas. Para cuantificar el número de estructuras autofágicas etiquetadas, se utilizó el software de código abierto FIJI con la ayuda de la herramienta “3D Objects Counter”.
La medida de los niveles autofágicos tanto en condiciones fisiológicas como en células cancerosas nos permite estudiar la modulación de la autofagia en diversas condiciones como la hipoxia, el tratamiento de quimioterapia o el derribo de ciertas proteínas.
Introduction
La macroautofagia (comúnmente conocida como autofagia) es un proceso catabólico especializado que degrada selectivamente los componentes citoplasmáticos, incluidas las proteínas y los orgánulos dañados 1,2. La autofagia permite a las células responder fisiológicamente a los estímulos de estrés y, así, mantener la homeostasis celular3. Durante la autofagia, se forma una vesícula de doble membrana: el autofagosoma. El autofagosoma contiene las moléculas de carga y las conduce al lisosoma para su degradación 1,4.
Los autofagosomas están decorados por la proteína autofágica de la cadena ligera 3 (CL3)5. Cuando no se induce la autofagia, la CL3 se difunde en el citoplasma y el núcleo en la conformación LC3-I. Por otro lado, cuando se induce la autofagia, la CL3 se conjuga con una fosfatidiletanolamina en la membrana de las estructuras autofágicas6. Esta nueva conformación LC3 se conoce como LC3-II1. El cambio de conformación de LC3 provoca cambios en su localización celular y su migración de electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE), que puede ser detectada por técnicas como la inmunofluorescencia y el western blot 5,7. De esta manera, la conjugación de CL3 es un evento clave en el proceso autofágico que se puede utilizar para medir la actividad autofágica.
La célula acinar pancreática es una célula altamente diferenciada que, en condiciones saludables, tiene una baja tasa de autofagia. Sin embargo, en diferentes condiciones fisiológicas o bajo estimulación farmacológica, pueden activar la autofagia. Por lo tanto, la determinación de los niveles autofágicos en esta línea celular es útil para estudiar los posibles efectos directos o indirectos de diferentes agentes farmacológicos o biológicos sobre la autofagia 8,9.
El adenocarcinoma pancreático ductal es uno de los tipos de cáncer más mortales, dado su diagnóstico tardío y su alta resistencia a la quimioterapia10. Las células de cáncer de páncreas tienen una alta actividad de autofagia debido a la regulación transcripcional positiva y la activación postraduccional de proteínas relacionadas con la autofagia11. Las células de cáncer de páncreas pueden ajustar sus niveles de autofagia en respuesta a condiciones desfavorables como hipoxia, privación de nutrientes o daño inducido por la quimioterapia11. Por lo tanto, analizar los niveles de autofagia en las células de cáncer de páncreas puede ayudar a comprender cómo se adaptan a diferentes entornos y evaluar la efectividad de los tratamientos moduladores de la autofagia.
Este estudio muestra un método para realizar la inmunofluorescencia de LC3 en dos modelos celulares pancreáticos distintos. El primer modelo, las células PANC-1, sirvió como modelo para el adenocarcinoma ductal pancreático. Estas células fueron tratadas con gemcitabina, un agente quimioterápico que previamente ha demostrado inducir autofagia, específicamente en células de cáncer de páncreas portadoras del gen oncogénico del virus del sarcoma de rata Kirsten (KRAS)12,13. El segundo modelo, las células AR42J, sirvió como un modelo más fisiológico de las células pancreáticas exocrinas. Estas células fueron diferenciadas con dexametasona para volverse más similares a las células pancreáticas acinares14. En estas células, la autofagia fue inducida farmacológicamente mediante el uso de PP242, que es un potente inhibidor de mTOR15. En este estudio, demostramos la aplicabilidad del protocolo descrito con dos modelos pancreáticos diferentes y su capacidad para discriminar entre estados de baja y alta autofagia.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método descrito en este protocolo permite visualizar la distribución endógena de CL3 en la célula y cuantificar los niveles autofágicos en diferentes condiciones. Otro método similar utilizado para analizar la distribución de CL3 y determinar la activación de la autofagia implica la transfección de LC3 marcada con fluorescencia (como RFP-LC3)19. La transfección RFP-LC3 tiene las ventajas de no necesitar fijación (lo que permite aplicar este método en imágenes de células vivas<sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por becas de la Universidad de Buenos Aires (UBACyT 2018-2020 20020170100082BA), el Consejo Nacional de Investigación Científica y Tecnológica (CONICET) (PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO; y PUE 22920170100033) y la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (PICT 2019-01664).
Materials
| 10x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 46-013-CM | |
| 12 mm round coverslips | HDA | CBR_OBJ_6467 | |
| 24 Well- Cell Culture Plate | Sorfa | 220300 | |
| Absolute ethanol | Biopack | 2207.10.00 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | R37119 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | Invitrogen | 62248 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | |
| DMEN | Sartorius | 01-052-1A | |
| Fetal Bovine Serum | NATOCOR | Lintc-634 | |
| Gemcitabina | Eli Lilly | VL7502 | |
| LC3B (D11) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 3868S | |
| Methanol | Anedra | 6197 | |
| Parafilm "M" (Laboratory Sealing Film) | Bemis/Curwood | PM-996 | |
| Pen-Strep Solution | Sartorius | 03-031-1B | |
| PP242 | Santa Cruz Biotechnology | SC-301606 | |
| Trypsin EDTA | Gibco | 11570626 |
References
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