Überwachung der Stub1-vermittelten Pexophagie
Summary
Dieses Protokoll enthält Anweisungen zum Auslösen und Überwachen der Stub1-vermittelten Pexophagie in lebenden Zellen.
Abstract
Säugetierzellen können Peroxisomen durch Stub1-vermittelte Pexophagie umwandeln. Der Signalweg ermöglicht möglicherweise die zelluläre Kontrolle der Quantität und Qualität von Peroxisomen. Während dieses Prozesses translozieren das Hitzeschockprotein 70 und die Ubiquitin-E3-Ligase Stub1 auf Peroxisomen, die umgedreht werden, um die Pexophagie zu initiieren. Die Aktivität der Stub1-Ligase ermöglicht die Akkumulation von Ubiquitin und anderen Autophagie-relevanten Modulen auf gezielten Peroxisomen. Eine Erhöhung des Spiegels der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) im peroxisomalen Lumen kann die Stub1-vermittelte Pexophagie aktivieren. Man kann daher die farbstoffgestützte ROS-Generierung nutzen, um diesen Signalweg auszulösen und zu überwachen. Dieser Artikel beschreibt die Verfahren zur Verwendung von zwei Klassen von Farbstoffen, fluoreszierenden Proteinen und synthetischen Fluorophoren, um die Pexophagie in Säugetierzellkulturen zu initiieren. Diese farbstoffgestützten Protokolle, die auf der ROS-Generierung basieren, können nicht nur verwendet werden, um alle Peroxisomen innerhalb einer Zellpopulation weltweit anzusprechen, sondern können auch die Manipulation einzelner Peroxisomen innerhalb einzelner Zellen ermöglichen. Wir beschreiben auch, wie die Stub1-vermittelte Pexophagie mit Hilfe der Lebendzellmikroskopie verfolgt werden kann.
Introduction
Peroxisomen sind an eine einzelne Membran gebundene Organellen, die in den meisten eukaryotischen Zellen vorkommen. Peroxisomen sind ein metabolisches Kompartiment, das für die Beta-Oxidation von sehr langkettigen Fettsäuren, den Purinkatabolismus und die Synthese von Etherphospholipiden und Gallensäuren unerlässlichist 1. Peroxisom-abgeleitetes Acetyl-CoA steuert die Lipidhomöostase, indem es die zentrale Signalübertragung im Stoffwechselreguliert 2. Daher ist es nicht verwunderlich, dass beeinträchtigte peroxisomale Funktionen bei verschiedenen Krankheiten impliziert sind, darunter neurodegenerative Erkrankungen, Alterung, Krebs, Fettleibigkeit und Diabetes 3,4,5. Ein wesentlicher Prozess bei der Aufrechterhaltung der peroxisomalen Operation ist die Pexophagie. Die Pexophagie ist ein kataboler Prozess für den selektiven Umsatz von Peroxisomen durch Autophagie. Zellen nutzen die Pexophagie, um die Quantität und Qualität der Peroxisomen zu kontrollieren und so eine ordnungsgemäße peroxisomale Funktion zu gewährleisten. Eine kürzlich durchgeführte Studie zeigte, dass der Peroxisomverlust, der durch Mutationen in den peroxisomalen PEX1-Biogenesefaktoren 1 und 6 verursacht wird, auf eine unkontrollierte Pexophagie zurückzuführenist 6. Bemerkenswert ist, dass 65 % aller Patienten mit Peroxisom-Biogenese-Störung (PBD) einen Mangel im peroxisomalen AAA-ATPase-Komplex aufweisen, der in Säugetierzellen aus PEX1, PEX6 und PEX26 besteht7.
Es gibt eine Reihe von Methoden, um die Pexophagie zu initiieren und zu untersuchen. In Hefe wird die Pexophagie ausgelöst, wenn die zugeführten Nährstoffe von peroxisomabhängigen Kohlenstoffquellen auf peroxisomunabhängige Kohlenstoffquellen umgestellt werden (um die zelluläre Peroxisomzahl zu senken)8. Zum Beispiel induziert der Transfer von Methanol-gezüchteten Pichia pastoris-Zellen von Methanolmedium auf Glukosemedium und Ethanolmedium Mikropexophagie bzw. Makropexophagie 8,9,10. Mikropexophagie sequestrierte gruppierte Peroxisomen für den Abbau, indem sie die Vakuole umbauten, um becherartige vakuoläre Sequestrierungsmembranen und eine deckelartige Struktur zu bilden, die als Mikropexophagie-spezifischer Membranapparat (MIPA) bezeichnet wird. Bei der Makropexophagie werden einzelne Peroxisomen von Doppelmembranstrukturen, den sogenannten Pexophagosomen, umhüllt, gefolgt von einer Fusion mit der Vakuole zum Abbau 8,9,10. Die Phosphorylierung von Pexophagierezeptoren, wie Atg36p in Saccharomyces cerevisiae und Atg30p in Pichia pastoris, ist entscheidend für die Rezeptoren, um die zentrale Autophagie-Maschinerie zu rekrutieren und das peroxisomale Targeting auf Autophagosomen zu erleichtern 8,11.
In Säugetierzellen kann Pexophagie durch Ubiquitinierung induziert werden. Die Markierung der peroxisomalen Membranproteine PMP34 oder PEX3 mit Ubiquitin auf der zytosolischen Seite induziert eine Pexophagie12. Die Überexpression von PEX3 induziert Peroxisom-Ubiquitinierung und Peroxisom-Eliminierung durch Lysosomen13. Darüber hinaus beeinträchtigt die Fusion von PEX5 mit einem C-terminalen EGFP den Export von monoubiquitiniertem PEX5 und führt zu einer Pexophagie14. Andererseits kann die Pexophagie auch durch eineH2O2-Behandlungausgelöst werden. Peroxisomen produzieren reaktive Sauerstoffspezies (ROS); Insbesondere das peroxisomale Enzym Acox1, das den ersten Schritt der Beta-Oxidation von sehr langkettigen Fettsäuren (> 22-Kohlenstoff) katalysiert, produziert nicht nur Acetyl-CoA, sondern auch peroxisomales ROS. Als Reaktion auf die erhöhten ROS-Werte unter H2O2-Behandlungaktivieren Säugetierzellen die Pexophagie, um die ROS-Produktion zu senken und Stress abzubauen. Es wurde berichtet, dass die Behandlung mit H 2 O2die Rekrutierung von Ataxie-Teleangiektasie-mutierten (ATM) zu Peroxisomen vorantreibt. ATM phosphoryliert dann PEX5, um den peroxisomalen Umsatz durch Pexophagie zu fördern15.
Da Peroxisomen ROS-erzeugende Zentren sind, sind sie auch anfällig für ROS-Schäden. ROS-induzierte peroxisomale Verletzungen zwingen die Zellen, die Pexophagie zu aktivieren, um Peroxisom-Qualitätskontrollwege zu initiieren (Entfernung des beschädigten Peroxisoms durch Autophagie). In dieser Arbeit skizzieren wir einen Ansatz für die On-Demand-Auslösung von ROS-induzierten peroxisomalen Verletzungen. Das Protokoll macht sich die lichtaktivierte ROS-Produktion in den Organellen 16,17,18,19,20 zunutze (Abbildung 1). Farbstoffmarkierte Peroxisomen werden beleuchtet, was zu einer ROS-Produktion im peroxisomalen Lumen führt, die spezifisch eine peroxisomale Schädigung auslöst. Mit Hilfe dieses Protokolls konnte gezeigt werden, dass ROS-gestresste Peroxisomen über einen Ubiquitin-abhängigen Abbauweg entfernt werden. ROS-gestresste Peroxisomen rekrutieren die Ubiquitin-E3-Ligase Stub1, damit sie in Autophagosomen einfließen können, um sie durch Pexophagie einzeln entfernenzu können 16. Man kann dieses Protokoll verwenden, um das Schicksal von verletzten und gesunden Peroxisomen innerhalb derselben Zelle durch Zeitraffermikroskopie zu vergleichen. Die Methode kann auch verwendet werden, um alle Peroxisomen (in allen Zellen) auf einer Kulturschale global zu schädigen, was die biochemische Analyse des Pexophagie-Signalwegs ermöglicht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt, wie Stub1-vermittelte Pexophagie in Zellkulturen ausgelöst werden kann, indem der peroxisomale ROS-Spiegel mit Licht erhöht wird. Da das Protokoll auf farbstoffgestützter ROS-Generierung beruht, muss eine ausreichende Expression von diKillerRed-VKSKL oder farbstoffmarkierten SLP-Liganden in den interessierenden Zellen sichergestellt werden. Angesichts der Tatsache, dass verschiedene Zelltypen oder Zellen mit unterschiedlichem genetischen Hintergrund Peroxisomen mit leicht unterschiedlichen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde zum Teil durch ein Forschungsstipendium MOST 111-2311-B-001-019-MY3 des National Science and Technology Council in Taiwan unterstützt.
Materials
| 35 mm culture dish with a 20 mm diameter glass microwell | MatTek | P35G-1.5-20-C | 20 mm glass bottomed |
| 3-amino-1,2,4-triazole (3-AT) | Sigma Aldrich | A8056 | |
| bovine serum | ThermoFisher Scientific | 16170060 | |
| Cell culture incubator | Nuaire | NU-4750 | |
| diKillerRed-PTS1 | Academia Sinica | made by appending the KillerRed tandem dimer with PTS1(VKSKL) | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) | ThermoFisher Scientific | 11330032 | |
| EGFP-C1 | Clontech | pEGFP-C1 | The backbone of EGFP-C1 was used for cloning EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62 |
| EGFP-Hsp70 | Academia Sinica | Hsp70 gene (HSPA1A) PCR amplified from HeLa cDNA and cloned into EGFP-C1 | |
| EGFP-LC3B | Addgene | 11546 | |
| EGFP-p62 | Academia Sinica | generated by inserting the human SQSTM1 gene (through PCR amplification of the HeLa cell cDNA) into EGFP-C1 | |
| EGFP-Stub1 | Academia Sinica | generated by inserting the mouse Stub1 gene (through PCR amplification of the total mouse kidney cDNA) into EGFP-C1 | |
| EGFP-Ub | Addgene | 11928 | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| HaloTag TMR ligand | Promega | G8252 | |
| HaloTag-PTS1 | Academia Sinica | PTS1 appended and cloned into EGFP-C1 backbone | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630080 | |
| Inverted Confocal Microscope | Olympus | FV3000RS | 405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex, microscope with a TOKAI HIT chamber incubator and the UNIV2-D35 dish attachment |
| Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand | Promega | GA1120 | |
| LED | VitaStar | PAR64 | 80 W, 555-570 nm |
| lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific | 11668 | transfection reagent |
| NIH3T3 cell | ATCC | CRL-1658 | adherent |
| Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 319850 | reduced serum media |
| penicillin/streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140 | |
| PMP34-TagBFP | Academia Sinica | PMP34 PCR amplified from HeLa cDNA and cloned intoTagBFP-C (Evrogen FP171) | |
| roGFP2-PTS1 | Academia Sinica | generated by appending eroGFP (taken from Addgene plasmid 20131) with the amino acid sequence VKSKL, and cloned into the EGFP-C1 | |
| SHSY5Y cell | ATCC | CRL-2266 | adherent |
References
- Wanders, R. J., Waterham, H. R., Ferdinandusse, S. Metabolic interplay between peroxisomes and other subcellular organelles including mitochondria and the endoplasmic reticulum. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 83 (2016).
- He, A., et al. Acetyl-CoA derived from hepatic peroxisomal β-oxidation inhibits autophagy and promotes steatosis via mTORC1 activation. Molecular Cell. 79 (1), 30.e4-42.e4 (2020).
- Cipolla, C. M., Lodhi, I. J. Peroxisomal dysfunction in age-related diseases. Trends in Endocrinology & Metabolism. 28 (4), 297-308 (2017).
- Fransen, M., Nordgren, M., Wang, B., Apanasets, O., Veldhoven, P. P. V. Aging, age-related diseases and peroxisomes. Peroxisomes and their Key Role in Cellular Signaling and Metabolism. 69, 45-65 (2013).
- Puri, P., et al. The plasma lipidomic signature of nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 50 (6), 1827-1838 (2009).
- Law, K. B., et al. The peroxisomal AAA ATPase complex prevents pexophagy and development of peroxisome biogenesis disorders. Autophagy. 13 (5), 868-884 (2017).
- Nazarko, T. Y. Pexophagy is responsible for 65% of cases of peroxisome biogenesis disorders. Autophagy. 13 (5), 991-994 (2017).
- Eberhart, T., Kovacs, W. J. Pexophagy in yeast and mammals: An update on mysteries. Histochemistry and Cell Biology. 150 (5), 473-488 (2018).
- Manjithaya, R., Nazarko, T. Y., Farré, J. -. C., Subramani, S. Molecular mechanism and physiological role of pexophagy. FEBS Letters. 584 (7), 1367-1373 (2010).
- Till, A., Lakhani, R., Burnett, S. F., Subramani, S. Pexophagy: The selective degradation of peroxisomes. International Journal of Cell Biology. 2012, 512721 (2012).
- Germain, K., Kim, P. K. Pexophagy: A model for selective autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (2), 578 (2020).
- Kim, P. K., Hailey, D. W., Mullen, R. T., Lippincott-Schwartz, J. Ubiquitin signals autophagic degradation of cytosolic proteins and peroxisomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20567-20574 (2008).
- Yamashita, S., Abe, K., Tatemichi, Y., Fujiki, Y. The membrane peroxin PEX3 induces peroxisome-ubiquitination-linked pexophagy. Autophagy. 10 (9), 1549-1564 (2014).
- Nordgren, M., et al. Export-deficient monoubiquitinated PEX5 triggers peroxisome removal in SV40 large T antigen-transformed mouse embryonic fibroblasts. Autophagy. 11 (8), 1326-1340 (2015).
- Zhang, J., et al. ATM functions at the peroxisome to induce pexophagy in response to ROS. Nature Cell Biology. 17 (10), 1259-1269 (2015).
- Chen, B. -. H., Chang, Y. -. J., Lin, S., Yang, W. Y. Hsc70/Stub1 promotes the removal of individual oxidatively stressed peroxisomes. Nature Communications. 11 (1), 5267 (2020).
- Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover. Nature Communications. 4, 2111 (2013).
- Mageswaran, S. K., Yang, W. Y., Chakrabarty, Y., Oikonomou, C. M., Jensen, G. J. A cryo-electron tomography workflow reveals protrusion-mediated shedding on injured plasma membrane. Science Advances. 7 (13), eabc6345 (2021).
- Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled initiation of parkin-mediated mitophagy within single cells. Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).
- Yang, J. Y., Yang, W. Y. Bit-by-bit autophagic removal of parkin-labelled mitochondria. Nature Communications. 4, 2428 (2013).
- Los, G. V., et al. HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).
- Lismont, C., Walton, P. A., Fransen, M. Quantitative monitoring of subcellular redox dynamics in living mammalian cells using RoGFP2-based probes. Methods in Molecular Biology. 1595, 151-164 (2017).
- Nordgren, M., et al. Potential limitations in the use of KillerRed for fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 245 (3), 229-235 (2012).
