ניטור Stub1-Mediated Pexophagy
Summary
פרוטוקול זה מספק הוראות להפעלה ולניטור של פקסופאגיה בתיווך Stub1 בתאים חיים.
Abstract
תאי יונקים יכולים להפוך פרוקסיזומים באמצעות פקסופאגיה בתיווך Stub1. המסלול מאפשר בקרה תאית על כמות ואיכות הפרוקסיזומים. במהלך תהליך זה, חלבון הלם חום 70 ויוביקוויטין E3 ליגאז, Stub1, עוברים לפרוקסיזומים כדי להפוך אותם כדי להתחיל פקסופגיה. פעילות ליגאז Stub1 מאפשרת הצטברות של יוביקוויטין ומודולים אחרים הקשורים לאוטופגיה על פרוקסיזומים ממוקדים. העלאת רמות החמצן הריאקטיבי (ROS) בלומן הפרוקסיזומלי יכולה להפעיל פקסופאגיה בתיווך Stub1. ניתן, אם כן, להשתמש ביצירת ROS בסיוע צבע כדי להפעיל ולנטר מסלול זה. מאמר זה מתאר את ההליכים לשימוש בשני סוגים של צבעים, חלבונים פלואורסצנטיים ופלואורופורים סינתטיים, כדי ליזום פקסופאגיה בתוך תרביות תאים של יונקים. פרוטוקולים מבוססי יצירת ROS בסיוע צבע אלה יכולים לשמש לא רק כדי להתמקד בכל הפרוקסיזומים באוכלוסיית תאים ברחבי העולם, אלא גם יכולים לאפשר מניפולציה של פרוקסיזומים בודדים בתוך תאים בודדים. אנו גם מתארים כיצד ניתן לעקוב אחר פקסופאגיה בתיווך Stub1 באמצעות מיקרוסקופ תאים חיים.
Introduction
פרוקסיזומים הם אברונים הקשורים לקרום יחיד הנמצאים ברוב התאים האיקריוטים. פרוקסיזומים הם תא מטבולי חיוני לביצוע חמצון בטא של חומצות שומן ארוכות שרשרת מאוד, קטבוליזם פורין, וסינתזה של פוספוליפידים וחומצות מרה באתר1. אצטיל-CoA המופק מפרוקסיזום שולט בהומאוסטזיס שומנים על ידי ויסות האיתות המרכזי בחילוף החומרים2. לכן, אין זה מפתיע כי תפקודים peroxisomal נפגע משתמע במחלות שונות, כולל הפרעות נוירודגנרטיביות, הזדקנות, סרטן, השמנת יתר, סוכרת 3,4,5. תהליך חיוני בשמירה על פעולה peroxisomal הוא pexophagy. פקסופאגיה היא תהליך קטבולי לתחלופה סלקטיבית של פרוקסיזומים על ידי אוטופגיה. תאים משתמשים בפקסופאגיה כדי לסייע בשליטה על כמות ואיכות הפרוקסיזומים, ובכך להבטיח תפקוד פרוקסיזומלי תקין. מחקר שנערך לאחרונה הראה כי אובדן פרוקסיזום שנגרם על ידי מוטציות בגורמים הביולוגיים PEX1 peroxisomal 1 ו -6 נובע מפקסופאגיה בלתי מבוקרת6. יש לציין כי 65% מכלל החולים בהפרעת ביוגנזה פרוקסיזומית (PBD) סובלים מליקויים בקומפלקס פרוקסיזומלי AAA ATPase, המורכב מ-PEX1, PEX6 ו-PEX26 בתאי יונקים7.
ניתן להשתמש במספר שיטות כדי ליזום וללמוד פקסופגיה. בשמרים, פקסופאגיה מופעלת כאשר חומרי המזון המסופקים עוברים ממקורות פחמן תלויי פרוקסיזום למקורות פחמן שאינם תלויים בפרוקסיזום (כדי להוריד את מספר הפרוקסיזום בתאים)8. לדוגמה, העברת תאי Pichia pastoris הגדלים מתנול ממדיום מתנול למדיום גלוקוז ומדיום אתנול משרה micropexophagy ו macropexophagy, בהתאמה 8,9,10. ממברנות מיקרופקסופאגיה קיבצו פרוקסיזומים לפירוק על ידי עיצוב מחדש של הוואקול ליצירת קרומי קיבוע ואקולריים דמויי גביע ומבנה דמוי מכסה המכונה מנגנון הממברנה הספציפי למיקרופקסופאגיה (MIPA). ב macropexophagy, peroxisomes בודדים נבלעים על ידי מבנים קרום כפול המכונה pexophagosomes, ואחריו איחוי עם vacuole עבור השפלה 8,9,10. הזרחן של קולטני פקסופגיה, כגון Atg36p ב- Saccharomyces cerevisiae ו- Atg30p ב– Pichia pastoris, הוא קריטי עבור הקולטנים לגייס מכונות אוטופגיה ליבה ולהקל על מיקוד פרוקסיזומלי לאוטופגוזומים 8,11.
בתאי יונקים, פקסופאגיה יכולה להיגרם על ידי יוביקוויטינציה. תיוג חלבוני הממברנה הפרוקסיזומלית PMP34 או PEX3 עם יוביקוויטין בצד הציטוסולי גורם לפקסופאגיה12. ביטוי היתר של PEX3 גורם לאוביקוויטינציה של פרוקסיזום וסילוק פרוקסיזום על ידי ליזוזומים13. בנוסף, המיזוג של PEX5 עם EGFP מסוף C פוגע בייצוא של PEX5 מונוביקוויטינציה וגורם לפקסופאגיה14. מצד שני, pexophagy יכול גם להיות מופעלות על ידי טיפול H 2 O2. פרוקסיזומים מייצרים מיני חמצן תגובתי (ROS); באופן ספציפי, האנזים הפרוקסיזומלי Acox1, אשר מזרז את השלב הראשוני של חמצון בטא של חומצות שומן ארוכות שרשרת מאוד (> 22 פחמן), מייצר לא רק אצטיל-CoA אלא גם ROS פרוקסיזומלי. בתגובה לרמות ROS מוגברות תחת טיפול H 2 O2, תאי יונקים מפעילים פקסופאגיה כדי להפחית את ייצור ה- ROS ולהקל על הלחץ. דווח כי טיפול H 2 O2מניע את הגיוס של אטקסיה-telangiectasia מוטציה (ATM) peroxisomes. כספומט לאחר מכן phosphorylates PEX5 כדי לקדם מחזור peroxisomal על ידי pexophagy15.
מאחר שפרוקסיזומים הם מרכזים המייצרים ROS, הם גם מועדים לנזק ל-ROS. פציעות פרוקסיזומליות המעוררות ROS מאלצות תאים להפעיל פקסופאגיה כדי ליזום מסלולי בקרת איכות פרוקסיזום (הסרת הפרוקסיזום הפגום על ידי אוטופגיה). כאן, אנו מתארים גישה להפעלה לפי דרישה של פגיעה פרוקסיזומלית הנגרמת על ידי ROS. הפרוטוקול מנצל את ייצור ה-ROS המופעל באמצעות אור בתוך אברונים 16,17,18,19,20 (איור 1). פרוקסיזומים המסומנים בצבע מוארים ומובילים לייצור ROS בלומן הפרוקסיזומלי, מה שגורם באופן ספציפי לפגיעה פרוקסיזומלית. באמצעות פרוטוקול זה, נראה כי פרוקסיזומים בסטרס של ROS מוסרים דרך מסלול פירוק תלוי יוביקוויטין. פרוקסיזומים בלחץ ROS מגייסים את היוביקוויטין E3 ליגאז Stub1 כדי לאפשר את בליעתם לתוך אוטופגוזומים להסרה פרטנית על ידי פקסופאגיה16. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי להשוות את גורלם של פרוקסיזומים פצועים ובריאים באותו תא באמצעות מיקרוסקופ בהילוך מהיר. השיטה יכולה לשמש גם לפגיעה גלובלית בכל הפרוקסיזומים (בכל התאים) על צלחת תרבית, מה שמאפשר ניתוח ביוכימי של מסלול הפקסופגיה.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מפרט כיצד להפעיל פקסופאגיה בתיווך Stub1 בתוך תרביות תאים על ידי העלאת רמות ROS פרוקסיזומליות עם אור. מכיוון שהפרוטוקול מסתמך על ייצור ROS בעזרת צבע, יש להבטיח ביטוי מספיק של diKillerRed-VKSKL או צביעת ליגנד SLP מסומן בצבע בתוך התאים המעניינים. בהתחשב בכך שסוגי תאים שונים או תאים בעלי רקע גנטי …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענק מחקר MOST 111-2311-B-001-019-MY3 מהמועצה הלאומית למדע וטכנולוגיה בטייוואן.
Materials
| 35 mm culture dish with a 20 mm diameter glass microwell | MatTek | P35G-1.5-20-C | 20 mm glass bottomed |
| 3-amino-1,2,4-triazole (3-AT) | Sigma Aldrich | A8056 | |
| bovine serum | ThermoFisher Scientific | 16170060 | |
| Cell culture incubator | Nuaire | NU-4750 | |
| diKillerRed-PTS1 | Academia Sinica | made by appending the KillerRed tandem dimer with PTS1(VKSKL) | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) | ThermoFisher Scientific | 11330032 | |
| EGFP-C1 | Clontech | pEGFP-C1 | The backbone of EGFP-C1 was used for cloning EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62 |
| EGFP-Hsp70 | Academia Sinica | Hsp70 gene (HSPA1A) PCR amplified from HeLa cDNA and cloned into EGFP-C1 | |
| EGFP-LC3B | Addgene | 11546 | |
| EGFP-p62 | Academia Sinica | generated by inserting the human SQSTM1 gene (through PCR amplification of the HeLa cell cDNA) into EGFP-C1 | |
| EGFP-Stub1 | Academia Sinica | generated by inserting the mouse Stub1 gene (through PCR amplification of the total mouse kidney cDNA) into EGFP-C1 | |
| EGFP-Ub | Addgene | 11928 | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| HaloTag TMR ligand | Promega | G8252 | |
| HaloTag-PTS1 | Academia Sinica | PTS1 appended and cloned into EGFP-C1 backbone | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630080 | |
| Inverted Confocal Microscope | Olympus | FV3000RS | 405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex, microscope with a TOKAI HIT chamber incubator and the UNIV2-D35 dish attachment |
| Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand | Promega | GA1120 | |
| LED | VitaStar | PAR64 | 80 W, 555-570 nm |
| lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific | 11668 | transfection reagent |
| NIH3T3 cell | ATCC | CRL-1658 | adherent |
| Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 319850 | reduced serum media |
| penicillin/streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140 | |
| PMP34-TagBFP | Academia Sinica | PMP34 PCR amplified from HeLa cDNA and cloned intoTagBFP-C (Evrogen FP171) | |
| roGFP2-PTS1 | Academia Sinica | generated by appending eroGFP (taken from Addgene plasmid 20131) with the amino acid sequence VKSKL, and cloned into the EGFP-C1 | |
| SHSY5Y cell | ATCC | CRL-2266 | adherent |
References
- Wanders, R. J., Waterham, H. R., Ferdinandusse, S. Metabolic interplay between peroxisomes and other subcellular organelles including mitochondria and the endoplasmic reticulum. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 83 (2016).
- He, A., et al. Acetyl-CoA derived from hepatic peroxisomal β-oxidation inhibits autophagy and promotes steatosis via mTORC1 activation. Molecular Cell. 79 (1), 30.e4-42.e4 (2020).
- Cipolla, C. M., Lodhi, I. J. Peroxisomal dysfunction in age-related diseases. Trends in Endocrinology & Metabolism. 28 (4), 297-308 (2017).
- Fransen, M., Nordgren, M., Wang, B., Apanasets, O., Veldhoven, P. P. V. Aging, age-related diseases and peroxisomes. Peroxisomes and their Key Role in Cellular Signaling and Metabolism. 69, 45-65 (2013).
- Puri, P., et al. The plasma lipidomic signature of nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 50 (6), 1827-1838 (2009).
- Law, K. B., et al. The peroxisomal AAA ATPase complex prevents pexophagy and development of peroxisome biogenesis disorders. Autophagy. 13 (5), 868-884 (2017).
- Nazarko, T. Y. Pexophagy is responsible for 65% of cases of peroxisome biogenesis disorders. Autophagy. 13 (5), 991-994 (2017).
- Eberhart, T., Kovacs, W. J. Pexophagy in yeast and mammals: An update on mysteries. Histochemistry and Cell Biology. 150 (5), 473-488 (2018).
- Manjithaya, R., Nazarko, T. Y., Farré, J. -. C., Subramani, S. Molecular mechanism and physiological role of pexophagy. FEBS Letters. 584 (7), 1367-1373 (2010).
- Till, A., Lakhani, R., Burnett, S. F., Subramani, S. Pexophagy: The selective degradation of peroxisomes. International Journal of Cell Biology. 2012, 512721 (2012).
- Germain, K., Kim, P. K. Pexophagy: A model for selective autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (2), 578 (2020).
- Kim, P. K., Hailey, D. W., Mullen, R. T., Lippincott-Schwartz, J. Ubiquitin signals autophagic degradation of cytosolic proteins and peroxisomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20567-20574 (2008).
- Yamashita, S., Abe, K., Tatemichi, Y., Fujiki, Y. The membrane peroxin PEX3 induces peroxisome-ubiquitination-linked pexophagy. Autophagy. 10 (9), 1549-1564 (2014).
- Nordgren, M., et al. Export-deficient monoubiquitinated PEX5 triggers peroxisome removal in SV40 large T antigen-transformed mouse embryonic fibroblasts. Autophagy. 11 (8), 1326-1340 (2015).
- Zhang, J., et al. ATM functions at the peroxisome to induce pexophagy in response to ROS. Nature Cell Biology. 17 (10), 1259-1269 (2015).
- Chen, B. -. H., Chang, Y. -. J., Lin, S., Yang, W. Y. Hsc70/Stub1 promotes the removal of individual oxidatively stressed peroxisomes. Nature Communications. 11 (1), 5267 (2020).
- Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover. Nature Communications. 4, 2111 (2013).
- Mageswaran, S. K., Yang, W. Y., Chakrabarty, Y., Oikonomou, C. M., Jensen, G. J. A cryo-electron tomography workflow reveals protrusion-mediated shedding on injured plasma membrane. Science Advances. 7 (13), eabc6345 (2021).
- Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled initiation of parkin-mediated mitophagy within single cells. Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).
- Yang, J. Y., Yang, W. Y. Bit-by-bit autophagic removal of parkin-labelled mitochondria. Nature Communications. 4, 2428 (2013).
- Los, G. V., et al. HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).
- Lismont, C., Walton, P. A., Fransen, M. Quantitative monitoring of subcellular redox dynamics in living mammalian cells using RoGFP2-based probes. Methods in Molecular Biology. 1595, 151-164 (2017).
- Nordgren, M., et al. Potential limitations in the use of KillerRed for fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 245 (3), 229-235 (2012).
