JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
自动翻译
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
环境科学

Kwantificering en karakterisering van het hele genoom van SARS-CoV-2-RNA in afvalwater- en luchtmonsters

Published: June 30, 2023
doi:
10.3791/65053
, , , , , , , , ,
1Institute of Sustainable Processes,University of Valladolid, 2Department of Chemical Engineering and Environmental Technology,University of Valladolid, 3Department of Public Health Microbiology,National Laboratory of Health, Environment and Food, 4ICBAS – School of Medicine and Biomedical Sciences,Porto University, 5Epidemiology Research Unit (EPIUnit),Instituto de Saúde Pública da Universidade do Porto, 6Laboratório para a Investigação Integrativa e Translacional em Saúde Populacional (ITR)

Summary

Dit protocol heeft tot doel SARS-CoV-2-RNA in afvalwater- en luchtmonsters te kwantificeren voor gebruik voor epidemiologische studies op basis van afvalwater en om het blootstellingsrisico aan SARS-CoV-2 in aerosolen binnen en buiten te beoordelen. Dit protocol beschrijft ook een betegelde amplicon long-template sequencing-benadering voor de karakterisering van het hele genoom van SARS-CoV-2.

Abstract

Op afvalwater gebaseerde epidemiologie is in veel landen naar voren gekomen als een veelbelovend en effectief bewakingssysteem voor SARS-CoV-2 en andere infectieziekten. Het proces omvat doorgaans afvalwaterconcentratie, nucleïnezuurextractie, amplificatie van geselecteerde genomische segmenten en detectie en kwantificering van het geamplificeerde genomische segment. Deze methodologie kan op dezelfde manier worden gebruikt om infectieuze agentia, zoals SARS-CoV-2, in luchtmonsters te detecteren en te kwantificeren. Aanvankelijk werd aangenomen dat SARS-CoV-2 zich voornamelijk verspreidde door nauw persoonlijk contact met druppeltjes die door een besmet persoon werden gegenereerd tijdens het spreken, niezen, hoesten, zingen of ademen. Een groeiend aantal onderzoeken heeft echter melding gemaakt van de aanwezigheid van SARS-CoV-2-RNA in de lucht van zorginstellingen, waardoor overdracht via de lucht een levensvatbare route voor het virus is. Deze studie presenteert een samenstelling van gevestigde protocollen om de detectie, kwantificering en sequentiebepaling van virussen uit zowel afvalwater- als luchtmonsters in het milieu te vergemakkelijken.

Introduction

In december 2019 dook een nieuwe ziekte op, COVID-19 genaamd, veroorzaakt door een voorheen onbekend coronavirus, SARS-CoV-21. De resulterende wereldwijde pandemie vormt een grote uitdaging voor klinische en volksgezondheidslaboratoria over de hele wereld, aangezien een groot aantal personen moet worden getest om de overdracht en prevalentie van virussen in de gemeenschap nauwkeurig te beoordelen. In veel regio’s is het echter economisch onhaalbaar om tijdig en ruimtelijk alomvattend het noodzakelijke testniveau te bereiken 2,3. De huidige surveillancesystemen op basis van individuele klinische diagnostiek zijn sterk afhankelijk van de ernst van de symptomen en individuele rapportage, evenals de mate waarin deze symptomen overlappen met bestaande ziekten die in de populatie circuleren 4,5,6,7,8,9,10. Bijgevolg draagt een groot aantal asymptomatische gevallen bij tot een aanzienlijke onderschatting van de ziektelast 7,11.

Vanwege deze uitdagingen werd op afvalwater gebaseerde epidemiologie (WBE) voor COVID-19-surveillance voorgesteld als aanvullende surveillancestrategie. WBE werd voor het eerst beschreven in 200112 en werd aanvankelijk gebruikt om cocaïne en andere illegale drugs op te sporen13. Deze benadering is gebaseerd op de veronderstelling dat het mogelijk is om de beginconcentratie te berekenen van elke stof die stabiel is in afvalwater en door de mens wordt uitgescheiden 8,12. WBE is in veel landen met succes geïmplementeerd als een aanvullend en efficiënt surveillancesysteem voor SARS-CoV-2 3,8,14,15,16. De meeste methoden om menselijke virussen in aquatische omgevingen te detecteren, volgen deze stappen: concentratie, nucleïnezuurextractie, amplificatie van het gekozen genomische segment (of segmenten) en detectie/kwantificering van het geamplificeerde genomische segment3.

Een andere belangrijke omgeving voor de detectie en kwantificering van SARS-CoV-2 is in luchtmonsters. Aanvankelijk werd gedacht dat SARS-CoV-2 voornamelijk werd overgedragen door nauw persoonlijk contact met ademhalingsdruppeltjes van aerosolen die door een geïnfecteerde persoon werden gegenereerd tijdens het spreken, niezen, hoesten, zingen of ademen17. Verschillende onderzoeken begonnen echter de aanwezigheid van SARS-CoV-2-RNA in de lucht te melden, vooral in zorginstellingen en andere gesloten ruimtes 18,19,20,21. Bewijs van de levensvatbaarheid van SARS-CoV-2 in luchtmonsters die binnenshuis in ziekenhuizen en andere gesloten ruimten zijn genomen, is gevonden wanneer de virusconcentratie voldoende hoog was22,23,2 4. Buitenstudies hebben over het algemeen geen bewijs van SARS-CoV-2 gevonden, behalve in drukke buitenruimtes 21,25,26,27,28,29. Vanaf nu is overdracht van SARS-CoV-2 via de lucht erkend als een wijze van overdracht30,31. Een recente overzichtsstudie toont de verschillen tussen buiten, waar de risico’s van overdracht via de lucht minimaal zijn buiten drukke gebieden, en binnenshuis, waar grotere risico’s aanwezig kunnen zijn in slecht geventileerde omgevingen waarin sterke bronnen (d.w.z. het aantal geïnfecteerde mensen) aanwezig kunnen zijn. Een recente uitgebreide overzichtsstudie heeft de substantiële verschillen aangetoond tussen de risico’s van overdracht via de lucht in buiten- en binnenomgevingen, met name in drukke gebieden met slechte ventilatie. De studie geeft aan dat het risico op overdracht via de lucht minimaal is in buitenomgevingen, waar een grotere hoeveelheid lucht beschikbaar is voor de verdunning en verspreiding van virusdeeltjes32. Deze bevindingen hebben belangrijke implicaties voor het volksgezondheidsbeleid en de richtlijnen met betrekking tot COVID-19. Door de aanzienlijke verschillen in transmissierisico’s tussen binnen- en buitenomgevingen te erkennen, kunnen beleidsmakers effectievere strategieën ontwikkelen om de verspreiding van het virus te beperken en de volksgezondheid te beschermen.

Er zijn verschillende methoden en protocollen voor de detectie, kwantificering en sequentiebepaling van SARS-CoV-2 uit verschillende omgevingsmonsters. Dit methodeartikel is bedoeld om een combinatie van gevestigde protocollen te presenteren waarmee laboratoria met verschillende capaciteitsniveaus omgevingsdetectie, kwantificering en sequencing van virussen uit afvalwater- en luchtmonsters kunnen uitvoeren.

Protocol

Alle hier beschreven methoden zijn elders gepubliceerd en bevatten kleine wijzigingen ten opzichte van de oorspronkelijke methoden. 1. Inzameling van afvalwater en voorbehandeling van monsters OPMERKING: Vanwege de lage concentraties SARS-CoV-2-RNA in omgevingsmonsters is de implementatie van een concentratiestap cruciaal voor een succesvolle detectie33,34,35…

Representative Results

De resultaten samengevat in tabel 3 tonen voorbeelden van de detectie en kwantificering van SARS-CoV-2-RNA in afvalwater- en luchtmonsters met behulp van de methode die in dit artikel wordt beschreven. Afvalwatermonsters werden verzameld bij afvalwaterzuiveringsinstallaties in Spanje en Slovenië en werden als positief beschouwd als de Ct minder dan 40 was in ten minste twee van de drie replicaten, waarbij kwantificering als geldig werd beschouwd als de Ct een variatie van minder dan 5% had. In Spanje en…

Discussion

Microbiële en virale detectie en kwantificering met behulp van (RT-)qPCR-methoden zijn wijdverbreid geaccepteerd vanwege hun opmerkelijke gevoeligheid. Deze technieken staan echter voor tal van uitdagingen bij het analyseren van omgevingsmonsters. Afvalwatermonsters bevatten een overvloed aan remmende stoffen die metingen kunnen vertekenen en misleidende resultaten kunnen opleveren. Om deze beperkingen aan te pakken en de precisie te verbeteren, werd een complex protocol bedacht, ontworpen en geïmplementeerd. Dit proto…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd uitgevoerd met financiële steun van de regionale regering van Castilla y León en het FEDER-programma (projecten CLU 2017-09, UIC315 en VA266P20).

Materials

Adapter+A25+A2:D19+A2:D20+A2+A2:D19 Oxford Nanopore EXP-AMII001 Sequencing
AllPrep PowerViral DNA/RNA Kit Qiagen 28000-50 RNA extraction kit
AMPure XP Beckman Coulter A63880 PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up
ARTIC SARS-CoV-2 Amplicon Panel IDT 10011442 SARS-CoV-2 genome amplification
Blunt/TA Ligase Master Mix NEB M0367S Library preparation
CENTRICON PLUS­70 10KDA. Fisher Scientific 10296062 Concentration filters
CORIOLIS COMPACT AIR SAMPLER Bertin Technologies 083-DU001 Air sampler
Duran laboratory bottles Merck Z305200-10EA Sampling Bottles
Flow Cell (R9.4.1) Oxford Nanopore FLO-MIN106D Sequencing
General labarotory consumables (tubes, qPCR plates, etc)
Ligation Sequencing Kit Oxford Nanopore SQK-LSK109 Sequencing
LunaScript RT SuperMix Kit NEB E3010  cDNA synthesis
Mengovirus extraction control Kit Biomérieux KMG Concentration control
Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes Thermofisher 5011-0012 Sample storage
Native Barcoding Expansion 1-12 (PCR-free Oxford Nanopore EXP-NBD104 Barcoding
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module NEB E7595 DNA repair
NEBNext VarSkip Short SARS-CoV-2 Primer Mixes NEB E7658 SARS-CoV-2 genome amplification
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer NEB B6058S Sequencing 
Phosphate buffered saline Merck P4474 Collection buffer
Phosphate-buffered saline (PBS, 1X), sterile-filtered Thermofisher J61196.AP Elution of air samples
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix NEB M0494S hot start DNA polymerase
Qubit RNA HS Assay Kit Thermofisher Q32852 RNA quantitation
SARS-CoV-2 RUO qPCR Primer & Probe Kit IDT 10006713 Primer-Probe mix and qPCR positive control
TaqPath 1-Step RT-qPCR Master Mix Thermofisher A15299 RT-qPCR kit
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Naming the Coronavirus Disease (COVID-19) and the Virus that Causes it. World Health Organization Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/technical-guidance/naming-the-coronavirus-disease (2020)
  2. Lab Workplace Safety. Centers for Disease Control and Prevention Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/lab-safety-practices.html (2020)
  3. Gonçalves, J., et al. Centralized and decentralized wastewater-based epidemiology to infer COVID-19 transmission – A brief review. One Health. 15, 100405 (2022).
  4. Dawood, F. S., et al. Estimated global mortality associated with the first 12 months of 2009 pandemic influenza A H1N1 virus circulation: a modelling study. The Lancet Infectious Diseases. 12 (9), 687-695 (2012).
  5. Gonçalves, J., Koritnik, T., Paragi, M. Assessment of weather and atmospheric pollution as a co-factor in the spread of SARS-CoV-2. Acta Bio-Medica: Atenei Parmensis. 92 (3), e2021094 (2021).
  6. Gonçalves, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA in hospital wastewater from a low COVID-19 disease prevalence area. The Science of The Total Environment. 755, 143226 (2021).
  7. Mizumoto, K., Kagaya, K., Zarebski, A., Chowell, G. Estimating the asymptomatic proportion of coronavirus disease 2019 (COVID-19) cases on board the Diamond Princess cruise ship, Yokohama, Japan, 2020. Eurosurveillance. 25 (10), 2000180 (2020).
  8. Polo, D., et al. Making waves: Wastewater-based epidemiology for COVID-19 – approaches and challenges for surveillance and prediction. Water Research. 186, 116404 (2020).
  9. Shmueli, G., Burkom, H. Statistical challenges facing early outbreak detection in biosurveillance. Technometrics. 52 (1), 39-51 (2010).
  10. Simonsen, L., et al. Global mortality estimates for the 2009 influenza pandemic from the GLaMOR project: A modeling study. PLoS Medicine. 10 (11), e1001558 (2013).
  11. Oran, D. P., Topol, E. J. Prevalence of asymptomatic SARS-CoV-2 infection: a narrative reivew. Annals of Internal Medicine. 173, 362-367 (2020).
  12. Daughton, C., Jones-Lepp, T. Pharmaceuticals and Personal Care Products in the Environment: Scientific and Regulatory Issues. ACS Symposium Series. , (2001).
  13. Zuccato, E., et al. Cocaine in surface waters: a new evidence-based tool to monitor community drug abuse. Environmental Health. 4, 14 (2005).
  14. Aguiar-Oliveira, M. d. e. L., et al. Wastewater-based epidemiology (WBE) and viral detection in polluted surface water: A valuable tool for COVID-19 surveillance-a brief review. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17, 9251 (2020).
  15. García-Encina, P. A. Wastewater-based epidemiology (WBE). Water and Environment Journal. 35 (4), 1162-1163 (2021).
  16. Mao, K., Zhang, H., Pan, Y., Yang, Z. Biosensors for wastewater-based epidemiology for monitoring public health. Water Research. 191, 116787 (2021).
  17. Shereen, M. A., Khan, S., Kazmi, A., Bashir, N., Siddique, R. COVID-19 infection: Origin, transmission, and characteristics of human coronaviruses. Journal of Advanced Research. 24, 91-98 (2020).
  18. Chia, P. Y., et al. Detection of air and surface contamination by SARS-CoV-2 in hospital rooms of infected patients. Nature Communications. 11 (1), 2800 (2020).
  19. Lei, H., et al. SARS-CoV-2 environmental contamination associated with persistently infected COVID-19 patients. Influenza and Other Respiratory Viruses. 14 (6), 688-699 (2020).
  20. Razzini, K., et al. SARS-CoV-2 RNA detection in the air and on surfaces in the COVID-19 ward of a hospital in Milan, Italy. The Science of The Total Environment. 742, 140540 (2020).
  21. da Silva, P. G., Gonçalves, J., Nascimento, M. S. J., Sousa, S. I. V., Mesquita, J. R. Detection of SARS-CoV-2 in the indoor and outdoor areas of urban public transport systems of three major cities of Portugal in 2021. International Journal of Environmental Research and Public Health. 19 (10), 5955 (2022).
  22. Barbieri, P., et al. Molecular detection of SARS-CoV-2 from indoor air samples in environmental monitoring needs adequate temporal coverage and infectivity assessment. Environmental Research. 198, 111200 (2021).
  23. Lednicky, J., et al. Earliest detection to date of SARS-CoV-2 in Florida: Identification together with influenza virus on the main entry door of a university building, February 2020. PLoS One. 16 (1), 0245352 (2021).
  24. Santarpia, J. L., et al. Aerosol and surface contamination of SARS-CoV-2 observed in quarantine and isolation care. Scientific Reports. 10 (1), 12732 (2020).
  25. Chirizzi, D., et al. SARS-CoV-2 concentrations and virus-laden aerosol size distributions in outdoor air in north and south of Italy. Environment International. 146, 106255 (2021).
  26. Hadei, M., et al. Presence of SARS-CoV-2 in the air of public places and transportation. Atmospheric Pollution Research. 12 (3), 302-306 (2021).
  27. Moreno, T., et al. Tracing surface and airborne SARS-CoV-2 RNA inside public buses and subway trains. Environment International. 147, 106326 (2021).
  28. Mouchtouri, V. A., et al. Environmental contamination of SARS-CoV-2 on surfaces, air-conditioner and ventilation systems. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 230, 113599 (2020).
  29. Setti, L., et al. Airborne transmission route of COVID-19: why 2 meters/6 feet of inter-personal distance could not be enough. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17, 2932 (2020).
  30. SARS-CoV-2 Transmission. Centers for Disease Control and Prevention (CDC) Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/science/science-briefs/sars-cov-2-transmission.html (2021)
  31. Coronavirus Disease (COVID-19): How is it Transmitted. World Health Organization Available from: https://www.who.int/news-room/q-a-detail/coronavirus-disease-covid-19-how-is-it-transmitted (2021)
  32. Dinoi, A., et al. A review on measurements of SARS-CoV-2 genetic material in air in outdoor and indoor environments: Implication for airborne transmission. The Science of the Total Environment. 809, 151137 (2022).
  33. Bosch, A., et al. Analytical methods for virus detection in water and food. Food Analytical Methods. 4, 4-12 (2011).
  34. Gonçalves, J., et al. Surveillance of human enteric viruses in coastal waters using concentration with methacrylate monolithic supports prior to detection by RT-qPCR. Marine Pollution Bulletin. 128, 307-317 (2018).
  35. La Rosa, G., Muscillo, M. Molecular detection of viruses in water and sewage. Viruses in Food and Water. , 97-125 (2013).
  36. Medema, G., Heijnen, L., Elsinga, G., Italiaander, R., Brouwer, A. Presence of SARS-Coronavirus-2 RNA in sewage and correlation with reported COVID-19 prevalence in the early stage of the epidemic in the Netherlands. Environmental Science & Technology Letters. 7 (7), 511-516 (2020).
  37. CDC – 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel Fact Sheet for Healthcare Providers. Centers for Disease Control and Prevention Available from: https://stacks.cdc.gov/view/cdc/85028 (2020)
  38. Conte, M. Airborne concentrations of SARS-CoV-2 in indoor community environments in Italy. Environmental Science and Pollution Research International. 29 (10), 13905-13916 (2022).
  39. nCoV-2019 sequencing protocol v3 (LoCost). protocols.io Available from: https://www.protocols.io/view/ncov-2019-sequencing-protocol-v3-locost-bh42j8ye (2020)
  40. Tyson, J. R. . Improvements to the ARTIC multiplex PCR method for SARS-CoV-2 genome sequencing using nanopore. , (2020).
  41. . ARTIC SARS-CoV-2 Workflow Available from: https://github.com/epi2me-labs/wf-artic (2022)
  42. Li, H., et al. The sequence alignment/map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  43. . Freyja Available from: https://github.com/andersen-lab/Freyja (2022)
  44. Li, H. A statistical framework for SNP calling, mutation discovery, association mapping and population genetical parameter estimation from sequencing data. Bioinformatics. 27 (21), 2987-2993 (2011).
  45. Grubaugh, N. D., et al. An amplicon-based sequencing framework for accurately measuring intrahost virus diversity using PrimalSeq and iVar. Genome Biology. 20 (1), 8 (2019).
  46. Hadfield, J., et al. Nextstrain: real-time tracking of pathogen evolution. Bioinformatics. 34 (23), 4121-4123 (2018).
  47. Aksamentov, I., Roemer, C., Hodcroft, E. B., Neher, R. A. Nextclade: clade assignment, mutation calling and quality control for viral genomes. Journal of Open Source Software. 6 (67), 3773 (2021).
  48. Markt, R., et al. Detection and stability of SARS-CoV-2 fragments in wastewater: impact of storage temperature. Pathogens. 10 (9), 1215 (2021).
  49. Kocamemi, B. A., et al. First Data-Set on SARS-CoV-2 Detection for Istanbul Wastewaters in Turkey. MedRxiv. , (2020).
  50. Randazzo, W., et al. SARS-CoV-2 RNA in wastewater anticipated COVID-19 occurrence in a low prevalence area. Water Research. 181, 115942 (2020).
  51. Hoorfar, J., et al. Practical considerations in design of internal amplification controls for diagnostic PCR assays. Journal of Clinical Microbiology. 42 (5), 1863-1868 (2004).
  52. Parshionikar, S. U., Cashdollar, J., Shay Fout, G. Development of homologous viral internal controls for use in RT-PCR assays of waterborne enteric viruses. Journal of Virological Methods. 121, 39-48 (2004).
  53. Nalla, A. K. Comparative performance of SARS-CoV-2 detection assays using seven different primer-probe sets and one assay kit. Journal of Clinical Microbiology. 58 (6), 00557 (2020).
  54. Hirotsu, Y., Mochizuki, H., Omata, M. Double-quencher probes improve detection sensitivity toward Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) in a reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) assay. Journal of Virological Methods. 284, 113926 (2020).
  55. Ahmed, W. First confirmed detection of SARS-CoV-2 in untreated wastewater in Australia: A proof of concept for the wastewater surveillance of COVID-19 in the community. The Science of The Total Environment. 728, 138764 (2020).
  56. Bar-Or, I., et al. Detection of SARS-CoV-2 variants by genomic analysis of wastewater samples in Israel. The Science of the Total Environment. 789, 148002 (2021).
  57. La Rosa, G., Bonadonna, L., Lucentini, L., Kenmoe, S., Suffredini, E. Coronavirus in water environments: Occurrence, persistence and concentration methods – A scoping review. Water Research. 179, 115899 (2020).
  58. Wu, F., et al. SARS-CoV-2 titers in wastewater are higher than expected from clinically confirmed cases. mSystems. 5, 00614 (2020).
  59. Wurtzer, S., et al. Evaluation of lockdown effect on SARS-CoV-2 dynamics through viral genome quantification in waste water, Greater Paris, France, 5 March to 23 April 2020. European Communicable Disease Bulletin. 25 (50), 2000776 (2020).
  60. . VATar COVID-19 | Caso de Exito – Ministerio para la Transición Ecologica y el Reto Demografico Available from: https://esri.es/es-es/descubre-los-gis/casos-de-exito/administracion-/vatar-covod19-miteco-cs (2022)
  61. Nemudryi, A., et al. Temporal detection and phylogenetic assessment of SARS-CoV-2 in municipal wastewater. Cell Reports. Medicine. 1 (6), 100098 (2020).
  62. Rios, G., et al. Monitoring SARS-CoV-2 variants alterations in Nice neighborhoods by wastewater nanopore sequencing. The Lancet Regional Health. Europe. 10, 100202 (2021).
  63. Gomes da Silva, P. Environmental dissemination of SARS-CoV-2 in a University Hospital during the COVID-19 5th wave Delta variant peak in Castile-León, Spain. International Journal of Environmental Research and Public Health. 20, 1574 (2023).
  64. Gonçalves, J., et al. . Exposure assessment of SARS-CoV-2 and Nov GII/GII in aerosols generated by a municipal wastewater treatment plant. , (2022).
  65. Lednicky, J. A., et al. Isolation of SARS-CoV-2 from the air in a car driven by a COVID patient with mild illness. International Journal of Infectious Diseases. 108, 212-216 (2021).

Tags

Wastewater-based EpidemiologySARS-CoV-2COVID-19Air SamplingViral RNART-qPCRMengovirusN1 GeneN2 GeneRNA ExtractionCentrifugal UltrafiltrationComposite Wastewater SampleMolecular Biology

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Gonçalves, J., Gomes da Silva, P., Koritnik, T., Bosilj, M., Torres-Franco, A., Diaz, I., Rodriguéz, E., Marcos, E., Mesquita, J. R., García-Encina, P. Quantification and Whole Genome Characterization of SARS-CoV-2 RNA in Wastewater and Air Samples. J. Vis. Exp. (196), e65053, doi:10.3791/65053 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image