JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
自动翻译
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
环境科学

Количественная оценка и полногеномная характеристика РНК SARS-CoV-2 в пробах сточных вод и воздуха

Published: June 30, 2023
doi:
10.3791/65053
, , , , , , , , ,
1Institute of Sustainable Processes,University of Valladolid, 2Department of Chemical Engineering and Environmental Technology,University of Valladolid, 3Department of Public Health Microbiology,National Laboratory of Health, Environment and Food, 4ICBAS – School of Medicine and Biomedical Sciences,Porto University, 5Epidemiology Research Unit (EPIUnit),Instituto de Saúde Pública da Universidade do Porto, 6Laboratório para a Investigação Integrativa e Translacional em Saúde Populacional (ITR)

Summary

Этот протокол направлен на количественную оценку РНК SARS-CoV-2 в пробах сточных вод и воздуха, которые будут использоваться для эпидемиологических исследований сточных вод, а также на оценку риска воздействия SARS-CoV-2 в аэрозолях внутри и снаружи помещений. Этот протокол также описывает подход к секвенированию с длинной матрицей с мозаичным ампликоном для характеристики всего генома SARS-CoV-2.

Abstract

Эпидемиология сточных вод стала многообещающей и эффективной системой эпиднадзора за SARS-CoV-2 и другими инфекционными заболеваниями во многих странах. Этот процесс обычно включает в себя концентрацию сточных вод, экстракцию нуклеиновых кислот, амплификацию выбранных сегментов генома, а также обнаружение и количественную оценку амплифицируемого сегмента генома. Эта методология также может быть использована для обнаружения и количественного определения инфекционных агентов, таких как SARS-CoV-2, в пробах воздуха. Первоначально предполагалось, что SARS-CoV-2 распространяется в основном при тесном личном контакте с каплями, выделяемыми инфицированным человеком во время разговора, чихания, кашля, пения или дыхания. Тем не менее, все больше исследований сообщают о присутствии РНК SARS-CoV-2 в воздухе медицинских учреждений, что делает передачу вируса воздушно-капельным путем жизнеспособным. Это исследование представляет собой совокупность установленных протоколов для облегчения обнаружения, количественной оценки и секвенирования вирусов в окружающей среде как в пробах сточных вод, так и в пробах воздуха.

Introduction

В декабре 2019 года появилось новое заболевание под названием COVID-19, вызванное ранее неизвестным коронавирусом SARS-CoV-21. Последовавшая за этим глобальная пандемия стала серьезной проблемой для клинических лабораторий и лабораторий общественного здравоохранения во всем мире, поскольку большое количество людей нуждается в тестировании для точной оценки передачи и распространенности вируса в сообществе. Однако во многих регионах достижение необходимого уровня тестирования в своевременном и пространственно-комплексном плане экономически нецелесообразно 2,3. Существующие системы эпиднадзора, основанные на индивидуальной клинической диагностике, в значительной степени зависят от тяжести симптомов и индивидуальных сообщений, а также от того, в какой степени эти симптомы пересекаются с существующими заболеваниями, циркулирующими в популяции 4,5,6,7,8,9,10. Следовательно, большое число бессимптомных случаев способствует значительной недооценке бремени болезни 7,11.

В связи с этими проблемами в качестве дополнительной стратегии эпиднадзора за COVID-19 была предложена эпидемиология сточных вод (ВБЭ). WBE был впервые описан в 2001 году и первоначально использовался для отслеживания кокаина и других незаконных наркотиков13. Этот подход основан на предположении, что можно рассчитать начальную концентрацию любого вещества, стабильного в сточных водах и выделяемого человеком 8,12. WBE успешно применяется во многих странах в качестве дополнительной и эффективной системы эпиднадзора за SARS-CoV-2 3,8,14,15,16. Большинство методов обнаружения вирусов человека в водной среде состоят из следующих этапов: концентрирование, экстракция нуклеиновых кислот, амплификация выбранного сегмента (или сегментов) генома и обнаружение/количественное определение амплифицированного сегментагенома 3.

Еще одной важной средой для обнаружения и количественного определения SARS-CoV-2 являются пробы воздуха. Первоначально предполагалось, что SARS-CoV-2 передается в основном при тесном личном контакте с респираторными каплями из аэрозолей, образующихся инфицированным человеком во время разговора, чихания, кашля, пения или дыхания17. Тем не менее, в нескольких исследованиях начали сообщать о присутствии РНК SARS-CoV-2 в воздухе, особенно в медицинских учреждениях и других закрытых помещениях 18,19,20,21. Доказательства жизнеспособности SARS-CoV-2 были обнаружены в пробах воздуха, взятых в помещениях больниц и других закрытых помещениях, когда концентрация вируса была достаточно высокой22,23,2 4. Исследования на открытом воздухе, как правило, не обнаружили никаких доказательств SARS-CoV-2, за исключением многолюдных открытых пространств 21,25,26,27,28,29. На данный момент воздушно-капельная передача SARS-CoV-2 признана способом передачи30,31. Недавнее обзорное исследование показывает различия между пребыванием на открытом воздухе, где риск передачи инфекции воздушно-капельным путем минимален за пределами мест скопления людей, и в помещениях, где более высокие риски могут присутствовать в плохо проветриваемых помещениях, в которых могут присутствовать сильные источники (т.е. количество инфицированных людей). Недавнее всестороннее обзорное исследование выявило существенные различия между рисками передачи инфекции воздушно-капельным путем на открытом воздухе и в помещениях, особенно в местах скопления людей с плохой вентиляцией. Исследование показывает, что риск передачи вируса воздушно-капельным путем минимален на открытом воздухе, где имеется больший объем воздуха, доступный для разбавления и рассеивания вирусных частиц32. Эти результаты имеют важное значение для политики и руководящих принципов в области общественного здравоохранения, связанных с COVID-19. Признавая значительные различия в рисках передачи инфекции в помещениях и на открытом воздухе, директивные органы могут разработать более эффективные стратегии по смягчению последствий распространения вируса и защите здоровья населения.

Существует множество методов и протоколов для обнаружения, количественного определения и секвенирования SARS-CoV-2 из различных образцов окружающей среды. В данной статье о методе представлена комбинация хорошо зарекомендовавших себя протоколов, которые позволяют лабораториям с различными уровнями производительности выполнять обнаружение, количественную оценку и секвенирование вирусов в пробах сточных вод и воздуха.

Protocol

Все методы, описанные здесь, были опубликованы в других изданиях и содержат небольшие изменения по сравнению с оригинальными методами. 1. Сбор сточных вод и предварительная обработка проб ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за низких концентраций РНК SARS-CoV-2 в образцах о…

Representative Results

Результаты, сведенные в таблицу 3 , показывают примеры обнаружения и количественного определения РНК SARS-CoV-2 в пробах сточных вод и воздуха с использованием метода, описанного в этой статье. Пробы сточных вод были собраны с очистных сооружений в Испании и Словении и считались по?…

Discussion

Обнаружение и количественное определение микроорганизмов и вирусов с использованием методов (ОТ-)qПЦР получило широкое признание благодаря своей исключительной чувствительности. Однако эти методы сталкиваются с многочисленными проблемами при анализе проб окружающей среды. Пробы ст?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была выполнена при финансовой поддержке Регионального правительства Кастилии и Леона и программы FEDER (проекты CLU 2017-09, UIC315 и VA266P20).

Materials

Adapter+A25+A2:D19+A2:D20+A2+A2:D19 Oxford Nanopore EXP-AMII001 Sequencing
AllPrep PowerViral DNA/RNA Kit Qiagen 28000-50 RNA extraction kit
AMPure XP Beckman Coulter A63880 PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up
ARTIC SARS-CoV-2 Amplicon Panel IDT 10011442 SARS-CoV-2 genome amplification
Blunt/TA Ligase Master Mix NEB M0367S Library preparation
CENTRICON PLUS­70 10KDA. Fisher Scientific 10296062 Concentration filters
CORIOLIS COMPACT AIR SAMPLER Bertin Technologies 083-DU001 Air sampler
Duran laboratory bottles Merck Z305200-10EA Sampling Bottles
Flow Cell (R9.4.1) Oxford Nanopore FLO-MIN106D Sequencing
General labarotory consumables (tubes, qPCR plates, etc)
Ligation Sequencing Kit Oxford Nanopore SQK-LSK109 Sequencing
LunaScript RT SuperMix Kit NEB E3010  cDNA synthesis
Mengovirus extraction control Kit Biomérieux KMG Concentration control
Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes Thermofisher 5011-0012 Sample storage
Native Barcoding Expansion 1-12 (PCR-free Oxford Nanopore EXP-NBD104 Barcoding
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module NEB E7595 DNA repair
NEBNext VarSkip Short SARS-CoV-2 Primer Mixes NEB E7658 SARS-CoV-2 genome amplification
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer NEB B6058S Sequencing 
Phosphate buffered saline Merck P4474 Collection buffer
Phosphate-buffered saline (PBS, 1X), sterile-filtered Thermofisher J61196.AP Elution of air samples
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix NEB M0494S hot start DNA polymerase
Qubit RNA HS Assay Kit Thermofisher Q32852 RNA quantitation
SARS-CoV-2 RUO qPCR Primer & Probe Kit IDT 10006713 Primer-Probe mix and qPCR positive control
TaqPath 1-Step RT-qPCR Master Mix Thermofisher A15299 RT-qPCR kit
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Naming the Coronavirus Disease (COVID-19) and the Virus that Causes it. World Health Organization Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/technical-guidance/naming-the-coronavirus-disease (2020)
  2. Lab Workplace Safety. Centers for Disease Control and Prevention Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/lab-safety-practices.html (2020)
  3. Gonçalves, J., et al. Centralized and decentralized wastewater-based epidemiology to infer COVID-19 transmission – A brief review. One Health. 15, 100405 (2022).
  4. Dawood, F. S., et al. Estimated global mortality associated with the first 12 months of 2009 pandemic influenza A H1N1 virus circulation: a modelling study. The Lancet Infectious Diseases. 12 (9), 687-695 (2012).
  5. Gonçalves, J., Koritnik, T., Paragi, M. Assessment of weather and atmospheric pollution as a co-factor in the spread of SARS-CoV-2. Acta Bio-Medica: Atenei Parmensis. 92 (3), e2021094 (2021).
  6. Gonçalves, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA in hospital wastewater from a low COVID-19 disease prevalence area. The Science of The Total Environment. 755, 143226 (2021).
  7. Mizumoto, K., Kagaya, K., Zarebski, A., Chowell, G. Estimating the asymptomatic proportion of coronavirus disease 2019 (COVID-19) cases on board the Diamond Princess cruise ship, Yokohama, Japan, 2020. Eurosurveillance. 25 (10), 2000180 (2020).
  8. Polo, D., et al. Making waves: Wastewater-based epidemiology for COVID-19 – approaches and challenges for surveillance and prediction. Water Research. 186, 116404 (2020).
  9. Shmueli, G., Burkom, H. Statistical challenges facing early outbreak detection in biosurveillance. Technometrics. 52 (1), 39-51 (2010).
  10. Simonsen, L., et al. Global mortality estimates for the 2009 influenza pandemic from the GLaMOR project: A modeling study. PLoS Medicine. 10 (11), e1001558 (2013).
  11. Oran, D. P., Topol, E. J. Prevalence of asymptomatic SARS-CoV-2 infection: a narrative reivew. Annals of Internal Medicine. 173, 362-367 (2020).
  12. Daughton, C., Jones-Lepp, T. Pharmaceuticals and Personal Care Products in the Environment: Scientific and Regulatory Issues. ACS Symposium Series. , (2001).
  13. Zuccato, E., et al. Cocaine in surface waters: a new evidence-based tool to monitor community drug abuse. Environmental Health. 4, 14 (2005).
  14. Aguiar-Oliveira, M. d. e. L., et al. Wastewater-based epidemiology (WBE) and viral detection in polluted surface water: A valuable tool for COVID-19 surveillance-a brief review. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17, 9251 (2020).
  15. García-Encina, P. A. Wastewater-based epidemiology (WBE). Water and Environment Journal. 35 (4), 1162-1163 (2021).
  16. Mao, K., Zhang, H., Pan, Y., Yang, Z. Biosensors for wastewater-based epidemiology for monitoring public health. Water Research. 191, 116787 (2021).
  17. Shereen, M. A., Khan, S., Kazmi, A., Bashir, N., Siddique, R. COVID-19 infection: Origin, transmission, and characteristics of human coronaviruses. Journal of Advanced Research. 24, 91-98 (2020).
  18. Chia, P. Y., et al. Detection of air and surface contamination by SARS-CoV-2 in hospital rooms of infected patients. Nature Communications. 11 (1), 2800 (2020).
  19. Lei, H., et al. SARS-CoV-2 environmental contamination associated with persistently infected COVID-19 patients. Influenza and Other Respiratory Viruses. 14 (6), 688-699 (2020).
  20. Razzini, K., et al. SARS-CoV-2 RNA detection in the air and on surfaces in the COVID-19 ward of a hospital in Milan, Italy. The Science of The Total Environment. 742, 140540 (2020).
  21. da Silva, P. G., Gonçalves, J., Nascimento, M. S. J., Sousa, S. I. V., Mesquita, J. R. Detection of SARS-CoV-2 in the indoor and outdoor areas of urban public transport systems of three major cities of Portugal in 2021. International Journal of Environmental Research and Public Health. 19 (10), 5955 (2022).
  22. Barbieri, P., et al. Molecular detection of SARS-CoV-2 from indoor air samples in environmental monitoring needs adequate temporal coverage and infectivity assessment. Environmental Research. 198, 111200 (2021).
  23. Lednicky, J., et al. Earliest detection to date of SARS-CoV-2 in Florida: Identification together with influenza virus on the main entry door of a university building, February 2020. PLoS One. 16 (1), 0245352 (2021).
  24. Santarpia, J. L., et al. Aerosol and surface contamination of SARS-CoV-2 observed in quarantine and isolation care. Scientific Reports. 10 (1), 12732 (2020).
  25. Chirizzi, D., et al. SARS-CoV-2 concentrations and virus-laden aerosol size distributions in outdoor air in north and south of Italy. Environment International. 146, 106255 (2021).
  26. Hadei, M., et al. Presence of SARS-CoV-2 in the air of public places and transportation. Atmospheric Pollution Research. 12 (3), 302-306 (2021).
  27. Moreno, T., et al. Tracing surface and airborne SARS-CoV-2 RNA inside public buses and subway trains. Environment International. 147, 106326 (2021).
  28. Mouchtouri, V. A., et al. Environmental contamination of SARS-CoV-2 on surfaces, air-conditioner and ventilation systems. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 230, 113599 (2020).
  29. Setti, L., et al. Airborne transmission route of COVID-19: why 2 meters/6 feet of inter-personal distance could not be enough. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17, 2932 (2020).
  30. SARS-CoV-2 Transmission. Centers for Disease Control and Prevention (CDC) Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/science/science-briefs/sars-cov-2-transmission.html (2021)
  31. Coronavirus Disease (COVID-19): How is it Transmitted. World Health Organization Available from: https://www.who.int/news-room/q-a-detail/coronavirus-disease-covid-19-how-is-it-transmitted (2021)
  32. Dinoi, A., et al. A review on measurements of SARS-CoV-2 genetic material in air in outdoor and indoor environments: Implication for airborne transmission. The Science of the Total Environment. 809, 151137 (2022).
  33. Bosch, A., et al. Analytical methods for virus detection in water and food. Food Analytical Methods. 4, 4-12 (2011).
  34. Gonçalves, J., et al. Surveillance of human enteric viruses in coastal waters using concentration with methacrylate monolithic supports prior to detection by RT-qPCR. Marine Pollution Bulletin. 128, 307-317 (2018).
  35. La Rosa, G., Muscillo, M. Molecular detection of viruses in water and sewage. Viruses in Food and Water. , 97-125 (2013).
  36. Medema, G., Heijnen, L., Elsinga, G., Italiaander, R., Brouwer, A. Presence of SARS-Coronavirus-2 RNA in sewage and correlation with reported COVID-19 prevalence in the early stage of the epidemic in the Netherlands. Environmental Science & Technology Letters. 7 (7), 511-516 (2020).
  37. CDC – 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel Fact Sheet for Healthcare Providers. Centers for Disease Control and Prevention Available from: https://stacks.cdc.gov/view/cdc/85028 (2020)
  38. Conte, M. Airborne concentrations of SARS-CoV-2 in indoor community environments in Italy. Environmental Science and Pollution Research International. 29 (10), 13905-13916 (2022).
  39. nCoV-2019 sequencing protocol v3 (LoCost). protocols.io Available from: https://www.protocols.io/view/ncov-2019-sequencing-protocol-v3-locost-bh42j8ye (2020)
  40. Tyson, J. R. . Improvements to the ARTIC multiplex PCR method for SARS-CoV-2 genome sequencing using nanopore. , (2020).
  41. . ARTIC SARS-CoV-2 Workflow Available from: https://github.com/epi2me-labs/wf-artic (2022)
  42. Li, H., et al. The sequence alignment/map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  43. . Freyja Available from: https://github.com/andersen-lab/Freyja (2022)
  44. Li, H. A statistical framework for SNP calling, mutation discovery, association mapping and population genetical parameter estimation from sequencing data. Bioinformatics. 27 (21), 2987-2993 (2011).
  45. Grubaugh, N. D., et al. An amplicon-based sequencing framework for accurately measuring intrahost virus diversity using PrimalSeq and iVar. Genome Biology. 20 (1), 8 (2019).
  46. Hadfield, J., et al. Nextstrain: real-time tracking of pathogen evolution. Bioinformatics. 34 (23), 4121-4123 (2018).
  47. Aksamentov, I., Roemer, C., Hodcroft, E. B., Neher, R. A. Nextclade: clade assignment, mutation calling and quality control for viral genomes. Journal of Open Source Software. 6 (67), 3773 (2021).
  48. Markt, R., et al. Detection and stability of SARS-CoV-2 fragments in wastewater: impact of storage temperature. Pathogens. 10 (9), 1215 (2021).
  49. Kocamemi, B. A., et al. First Data-Set on SARS-CoV-2 Detection for Istanbul Wastewaters in Turkey. MedRxiv. , (2020).
  50. Randazzo, W., et al. SARS-CoV-2 RNA in wastewater anticipated COVID-19 occurrence in a low prevalence area. Water Research. 181, 115942 (2020).
  51. Hoorfar, J., et al. Practical considerations in design of internal amplification controls for diagnostic PCR assays. Journal of Clinical Microbiology. 42 (5), 1863-1868 (2004).
  52. Parshionikar, S. U., Cashdollar, J., Shay Fout, G. Development of homologous viral internal controls for use in RT-PCR assays of waterborne enteric viruses. Journal of Virological Methods. 121, 39-48 (2004).
  53. Nalla, A. K. Comparative performance of SARS-CoV-2 detection assays using seven different primer-probe sets and one assay kit. Journal of Clinical Microbiology. 58 (6), 00557 (2020).
  54. Hirotsu, Y., Mochizuki, H., Omata, M. Double-quencher probes improve detection sensitivity toward Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) in a reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) assay. Journal of Virological Methods. 284, 113926 (2020).
  55. Ahmed, W. First confirmed detection of SARS-CoV-2 in untreated wastewater in Australia: A proof of concept for the wastewater surveillance of COVID-19 in the community. The Science of The Total Environment. 728, 138764 (2020).
  56. Bar-Or, I., et al. Detection of SARS-CoV-2 variants by genomic analysis of wastewater samples in Israel. The Science of the Total Environment. 789, 148002 (2021).
  57. La Rosa, G., Bonadonna, L., Lucentini, L., Kenmoe, S., Suffredini, E. Coronavirus in water environments: Occurrence, persistence and concentration methods – A scoping review. Water Research. 179, 115899 (2020).
  58. Wu, F., et al. SARS-CoV-2 titers in wastewater are higher than expected from clinically confirmed cases. mSystems. 5, 00614 (2020).
  59. Wurtzer, S., et al. Evaluation of lockdown effect on SARS-CoV-2 dynamics through viral genome quantification in waste water, Greater Paris, France, 5 March to 23 April 2020. European Communicable Disease Bulletin. 25 (50), 2000776 (2020).
  60. . VATar COVID-19 | Caso de Exito – Ministerio para la Transición Ecologica y el Reto Demografico Available from: https://esri.es/es-es/descubre-los-gis/casos-de-exito/administracion-/vatar-covod19-miteco-cs (2022)
  61. Nemudryi, A., et al. Temporal detection and phylogenetic assessment of SARS-CoV-2 in municipal wastewater. Cell Reports. Medicine. 1 (6), 100098 (2020).
  62. Rios, G., et al. Monitoring SARS-CoV-2 variants alterations in Nice neighborhoods by wastewater nanopore sequencing. The Lancet Regional Health. Europe. 10, 100202 (2021).
  63. Gomes da Silva, P. Environmental dissemination of SARS-CoV-2 in a University Hospital during the COVID-19 5th wave Delta variant peak in Castile-León, Spain. International Journal of Environmental Research and Public Health. 20, 1574 (2023).
  64. Gonçalves, J., et al. . Exposure assessment of SARS-CoV-2 and Nov GII/GII in aerosols generated by a municipal wastewater treatment plant. , (2022).
  65. Lednicky, J. A., et al. Isolation of SARS-CoV-2 from the air in a car driven by a COVID patient with mild illness. International Journal of Infectious Diseases. 108, 212-216 (2021).

Tags

Wastewater-based EpidemiologySARS-CoV-2COVID-19Air SamplingViral RNART-qPCRMengovirusN1 GeneN2 GeneRNA ExtractionCentrifugal UltrafiltrationComposite Wastewater SampleMolecular Biology

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Gonçalves, J., Gomes da Silva, P., Koritnik, T., Bosilj, M., Torres-Franco, A., Diaz, I., Rodriguéz, E., Marcos, E., Mesquita, J. R., García-Encina, P. Quantification and Whole Genome Characterization of SARS-CoV-2 RNA in Wastewater and Air Samples. J. Vis. Exp. (196), e65053, doi:10.3791/65053 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image