Концентрация вирусных частиц в пробах воды и сточных вод окружающей среды с использованием флокуляции и ультрафильтрации обезжиренного молока
Summary
Концентрация вирусов в пробах воды и сточных вод окружающей среды представляет собой сложную задачу, выполняемую главным образом для идентификации и количественной оценки вирусов. Несмотря на то, что было разработано и протестировано несколько методов концентрации вирусов, мы демонстрируем здесь эффективность ультрафильтрации и флокуляции обезжиренного молока для РНК-вирусов с различными типами образцов.
Abstract
Эпидемиология, основанная на водных ресурсах и сточных водах, стала альтернативным методом мониторинга и прогнозирования хода вспышек в сообществах. Извлечение микробных фракций, включая вирусы, бактерии и микроэукариоты, из сточных вод и проб воды окружающей среды является одним из сложных шагов в этих подходах. В этом исследовании мы сосредоточились на эффективности восстановления методов последовательной ультрафильтрации и флокуляции обезжиренного молока (SMF) с использованием бронированной РНК в качестве тестового вируса, который также используется в качестве контроля в некоторых других исследованиях. Предварительная фильтрация мембранными дисковыми фильтрами 0,45 мкм и 0,2 мкм применялась для удаления твердых частиц перед ультрафильтрацией для предотвращения засорения ультрафильтрационных устройств. Испытуемые образцы, обработанные методом последовательной ультрафильтрации, центрифугировали на двух разных скоростях. Увеличение скорости привело к снижению уровня восстановления и положительности бронированной РНК. С другой стороны, SMF приводил к относительно последовательному восстановлению и положительным показателям бронированной РНК. Дополнительные тесты, проведенные с пробами воды из окружающей среды, продемонстрировали полезность SMF для концентрирования других микробных фракций. Разделение вирусов на твердые частицы может повлиять на общую скорость извлечения, учитывая стадию предварительной фильтрации, применяемую перед ультрафильтрацией проб сточных вод. SMF с предварительной фильтрацией показал лучшую эффективность при нанесении на пробы воды из окружающей среды из-за более низких концентраций твердых веществ в пробах и, следовательно, более низких скоростей разделения на твердые частицы. В настоящем исследовании идея использования метода последовательной ультрафильтрации возникла из-за необходимости снижения конечного объема вирусных концентратов в период пандемии COVID-19, когда поставки широко используемых ультрафильтрационных устройств были ограничены, и возникла необходимость в разработке альтернативных методов концентрации вируса.
Introduction
Определение эффективной концентрации микроорганизмов в пробах поверхностных и сточных вод для анализа микробных сообществ и эпидемиологических исследований является одним из важных шагов для мониторинга и прогнозирования течения вспышек в сообществах 1,2. Пандемия COVID-19 раскрыла важность совершенствования методов концентрации. COVID-19 возник в конце 2019 года и по состоянию на март 2023 года по-прежнему представляет угрозу для здоровья людей, социальной жизни и экономики. Эффективные стратегии эпиднадзора и контроля для смягчения последствий вспышек COVID-19 в сообществах стали важной темой исследований, поскольку в дополнение к быстрой передаче и распространению вируса появляются новые волны и варианты COVID-19, а также незарегистрированные и недиагностированные бессимптомные случаи 3,4,5. Использование эпидемиологии COVID-19 на основе сточных вод организациями гражданского общества, государственными учреждениями и государственными или частными коммунальными службами помогло быстро предоставить информацию, связанную со вспышками, и смягчить последствия вспышек COVID-19 6,7,8,9. Тем не менее, концентрация SARS-CoV-2, вируса РНК в оболочке, в образцах сточных вод по-прежнему создает проблемы10. Например, одной из таких проблем является разделение SARS-CoV-2 в твердых частицах сточных вод, что может повлиять на восстановление, когда твердые вещества удаляются во время концентрации11. Если это так, то при количественном определении/оценке основное внимание следует уделять как твердой, так и водной фазам проб воды в окружающей среде, а не только водной фазе. Кроме того, выбор метода концентрирования может быть изменен на основе последующих испытаний и анализов. Концентрация вирусных частиц и патогенов в образцах окружающей среды стала актуальной темой исследований с разработками в области секвенирования и микробиома.
Различные методы концентрации вируса применялись в области концентрации вируса в пробах воды и сточных вод окружающей среды. Некоторые часто используемые методы: фильтрация, флокуляция обезжиренного молока (SMF), адсорбция/элюирование и осаждение полиэтиленгликоля12-17. Среди них SMF считается дешевым и эффективным методом, успешно протестированным и применяемым для извлечения вирусов, включая SARS-CoV-2, из сточных и поверхностных вод12,15,16,18. Процедура SMF является относительно новым подходом, который получил все большее признание во многих экологических исследованиях в качестве подходящей методологии для одновременного извлечения широкого спектра микроорганизмов, таких как вирусы, бактерии и простейшие, из всех типов проб воды, а именно из проб ила, неочищенных сточных вод, сточных вод и сточных вод19. По сравнению с другими известными методологиями извлечения вирусов из образцов окружающей среды, такими как ультрафильтрация и глицин-щелочное элюирование, подход, основанный на лиофилизации, или ультрацентрифугирование и глицин-щелочное элюирование, SMF был признан наиболее эффективным методом с более высокими показателями восстановления и обнаружения вирусов18,20. В настоящем исследовании мы использовали бронированную РНК в качестве тестового вируса для оценки эффективности восстановления методами концентрации вируса, включая тесты для оценки восстановления SARS-CoV-221,22.
Здесь мы протестировали образцы сточных вод и воды окружающей среды, чтобы продемонстрировать полезность SMF и последовательного метода ультрафильтрации для концентрирования микробных фракций для количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР), метагеномики на основе последовательностей и секвенирования с глубоким ампликоном. SMF является относительно более дешевым методом и оптимален для большего объема образцов по сравнению с методами ультрафильтрации. Идея использования метода последовательной ультрафильтрации возникла из-за необходимости уменьшить конечный объем вирусных концентратов во время пандемии COVID-19, когда поставки широко используемых ультрафильтрационных устройств были ограничены, и возникла необходимость в разработке альтернативных методов концентрации вируса.
Protocol
Representative Results
Discussion
Одним из важнейших этапов этого исследования является удаление твердых частиц путем применения этапа предварительной фильтрации с мембранными фильтрами 0,2 мкм и 0,45 мкм. Учитывая разделение вирусов на твердые частицы, особенно оболочечные вирусы, предварительная фильтрация может при?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом NSERC Alliance Covid-19 (награда No 431401363, 2020-2021 гг., доктора Юань и Уягуари-Диас). MUD благодарит Программу университетских исследовательских грантов (награда No 325201). И JF, и JZA поддерживаются программой обучения выпускников Visual and Automated Disease Analytics (VADA). KY и JF получили стипендии в рамках программы Mitacs Accelerate. MUD и его сотрудники лаборатории (KY, JF, JZA) поддерживаются NSERC-DG (RGPIN-2022-04508) и грантом Research Manitoba New Investigator Operating (No 5385). Особая благодарность городу Виннипег, Манитоба. Это исследование было проведено в Университете Манитобы. Мы хотели бы признать, что кампусы Университета Манитобы расположены на исконных землях народов анишинабег, кри, оджи-кри, дакота и дене, а также на родине нации метисов.
Materials
| 0.2 M sodium phosphate buffer with a pH 7.5 | Alfa Aesar | J62041AP | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| 0.2 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters | VWR | 66234 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| 0.45 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters | VWR | 60043 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| 4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444432 | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA |
| Armored RNA Quant IPC-1 Processing Control | Asuragen | 49650 | Asuragen, Austin, TX, USA |
| Brand A, Jumbosep Centrifugal Device, 30-kDa | Pall | OD030C65 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Brand B, Microsep Advance Centrifugal Device, 30-kDa | Pall | MCP010C46 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Centrifuge tubes (50 ml) | Nalgene | 3119-0050PK | Thermo Fisher Scientific |
| DNAse I | Invitrogen | 18047019 | Thermo Fisher Scientific |
| Dyna Mag-2 | Invitrogen | 12027 | Thermo Fisher Scientific |
| GWV High Capacity Groundwater Sampling Capsules – 0.45 µm | Pall | 12179 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Hydrochloric acid, 1N standard solution | Thermo Fisher Scientific | AC124210025 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit | Applied biosystems | A42358 | Thermo Fisher Scientific |
| Nuclease free water | Promega | P1197 | Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA |
| Peristaltic pump | Masterflex, Cole-Parmer instrument | 7553-20 | Thermo Fisher Scientific |
| pH meter | Denver instrument | RK-59503-25 | Cole-Parmer. This product has been discontinued |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 | Invitrogen | 15593031 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| Primers and probe sets | IDT | Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA | |
| Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome kit | Qiagen | Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | A34322 | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA |
| Qubit 1X dsDNA High Sensitivity (HS) assay kit | Invitrogen | Q33231 | Thermo Fisher Scientific |
| Qubit 4 Fluorometer, with WiFi | Invitrogen | Q33238 | Thermo Fisher Scientific |
| Qubit RNA High Sensitivity (HS) assay kit | Invitrogen | Q32855 | Thermo Fisher Scientific |
| RNAse A | Invitrogen | EN0531 | Thermo Fisher Scientific |
| RNeasy PowerMicrobiome Kit | Qiagen | 26000-50 | Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA |
| Skim milk powder | Difco (BD Life Sciences) | DF0032173 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| Sodium phosphate buffer | Alfa Aesar | Alfa Aesar, Ottawa, ON, Canada | |
| Synthetic seawater | VWR | RC8363-1 | RICCA chemical company |
| Synthetic single-stranded DNA gBlock | IDT | Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA | |
| VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices – 0.1 µm, 90 mm, gamma-irradiated | Pall | 4621 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices – 0.2 µm, 90 mm, gamma-irradiated | Pall | 4622 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
References
- Kumblathan, T., Liu, Y., Uppal, G. K., Hrudey, S. E., Lix, X. F. Wastewater-based epidemiology for community monitoring of SARS-CoV-2: progress and challenges. ACS Environmental Au. 1, 18-31 (2021).
- Lu, D., Huang, Z., Luo, J., Zhang, X., Sha, S. Primary concentration-The critical step in implementing the wastewater based epidemiology for the COVID-19 pandemic: A mini-review. The Science of The Total Environment. 747, 141245 (2020).
- Bi, Q. Insights into household transmission of SARS-CoV-2 from a population-based serological survey. Nature Communications. 12, 3643 (2021).
- Day, M. Covid-19: identifying and isolating asymptomatic people helped eliminate virus in Italian village. British Medical Journal. 368, 1165 (2020).
- Ing, A. J., Cocks, C., Green, J. P. COVID-19: in the footsteps of Ernest Shackleton. Thorax. 75 (8), 693-694 (2020).
- Bivins, A., et al. Wastewater-based epidemiology: global collaborative to maximize contributions in the fight against COVID-19. Environmental Science & Technology. 54 (13), 7754-7757 (2020).
- Medema, G., Heijnen, L., Elsinga, G., Italiaander, R., Brouwer, A. Presence of SARS-Coronavirus-2 RNA in sewage and correlation with reported COVID-19 prevalence in the early stage of the epidemic in the Netherlands. Environmental Science & Technology Letters. 7 (7), 511-516 (2020).
- Thompson, J. R., et al. Making waves: Wastewater surveillance of SARS-CoV-2 for population-based health management. Water Research. 184, 116181 (2020).
- Wu, F., et al. SARS-CoV-2 RNA concentrations in wastewater foreshadow dynamics and clinical presentation of new COVID-19 cases. The Science of the Total Environment. 805, 150121 (2022).
- Kantor, R. S., Nelson, K. L., Greenwald, H. D., Kennedy, L. C. Challenges in measuring the recovery of SARS-CoV-2 from wastewater. Environmental Science & Technology. 55 (6), 3514-3519 (2021).
- Chik, A. H. S., et al. Comparison of approaches to quantify SARS-CoV-2 in wastewater using RT-qPCR: Results and implications from a collaborative inter-laboratory study in Canada. Journal of Environmental Sciences. 107, 218-229 (2021).
- Hjelmsø, M. H., et al. Evaluation of methods for the concentration and extraction of viruses from sewage in the context of metagenomic sequencing. PLoS One. 12 (1), e0170199 (2017).
- Philo, S. E., et al. A comparison of SARS-CoV-2 wastewater concentration methods for environmental surveillance. The Science of the Total Environment. 760, 144215 (2021).
- Ahmed, W., Harwood, V. J., Gyawali, P., Sidhu, J. P. S., Toze, S. Comparison of concentration methods for quantitative detection of sewage-associated viral markers in environmental waters. Applied and Environmental Microbiology. 81 (6), 2042-2049 (2015).
- Calgua, B., et al. Detection and quantification of classic and emerging viruses by skimmed-milk flocculation and PCR in river water from two geographical areas. Water Research. 47 (8), 2797-2810 (2013).
- Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
- Cashdollar, J. L., Wymer, L. Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies. Journal of Applied Microbiology. 115 (1), 1-11 (2013).
- Calgua, B., et al. New methods for the concentration of viruses from urban sewage using quantitative PCR. Journal of Virological Methods. 187 (2), 215-221 (2013).
- Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).
- Assis, A. S. F., et al. Optimization of the skimmed-milk flocculation method for recovery of adenovirus from sludge. The Science of the Total Environment. 583, 163-168 (2017).
- Goncharova, E. A., et al. One-step quantitative RT-PCR assay with armored RNA controls for detection of SARS-CoV-2. Journal of Medical Virology. 93 (3), 1694-1701 (2021).
- Yu, X. F., et al. Preparation of armored RNA as a control for multiplex real-time reverse transcription-PCR detection of influenza virus and severe acute respiratory syndrome coronavirus. Journal of Clinical Microbiology. 46 (3), 837-841 (2008).
- Alygizakis, N., et al. Analytical methodologies for the detection of SARS-CoV-2 in wastewater: Protocols and future perspectives. Trends in Analytical Chemistry. 134, 116125 (2021).
- Garcia, A., et al. Quantification of human enteric viruses as alternative indicators of fecal pollution to evaluate wastewater treatment processes. PeerJ. 10, e12957 (2022).
- Gonzalez, R., et al. COVID-19 surveillance in Southeastern Virginia using wastewater-based epidemiology. Water Research. 186, 116296 (2020).
- Hietala, S. K., Crossley, B. M. Armored RNA as virus surrogate in a real-time reverse transcriptase PCR assay proficiency panel. Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 67-70 (2006).
- Uyaguari-Diaz, M. I., et al. A comprehensive method for amplicon-based and metagenomic characterization of viruses, bacteria, and eukaryotes in freshwater samples. Microbiome. 4 (1), 20 (2016).
- Meena, G. S., Singh, A. K., Gupta, V. K., Borad, S., Parmar, P. T. Effect of change in pH of skim milk and ultrafiltered/diafiltered retentates on milk protein concentrate (MPC70) powder properties. Journal of Food Science and Technology. 55 (9), 3526-3537 (2018).
- . Geneious Available from: https://www.geneious.com (2021)
- Ye, Y., Ellenberg, R. M., Graham, K. E., Wigginton, K. R. Survivability, partitioning, and recovery of enveloped viruses in untreated municipal wastewater. Environmental Science & Technology. 50 (10), 5077-5085 (2016).
- Philo, S. E., et al. Development and validation of the skimmed milk pellet extraction protocol for SARS-CoV-2 wastewater surveillance. Food and Environmental Virology. 14 (4), 355-363 (2022).
- Monteiro, S., et al. Recovery of SARS-CoV-2 from large volumes of raw wastewater is enhanced with the inuvai R180 system. Journalof Environmental Management. 304, 114296 (2022).
- Yanaç, K., Adegoke, A., Wang, L., Uyaguari, M., Yuan, Q. Detection of SARS-CoV-2 RNA throughout wastewater treatment plants and a modeling approach to understand COVID-19 infection dynamics in Winnipeg, Canada. The Science of The Total Environment. 825, 153906 (2022).
