Summary

Elucidación del metabolismo del 2,4-dibromofenol en plantas

Published: February 10, 2023
doi:

Summary

El presente protocolo describe un método simple y eficiente para la identificación de metabolitos de 2,4-dibromofenol en plantas.

Abstract

Los cultivos pueden estar ampliamente expuestos a contaminantes orgánicos, ya que el suelo es un sumidero importante para los contaminantes desechados en el medio ambiente. Esto crea una exposición humana potencial a través del consumo de alimentos acumulados con contaminantes. Esclarecer la absorción y el metabolismo de los xenobióticos en los cultivos es esencial para evaluar el riesgo de exposición alimentaria en los seres humanos. Sin embargo, para tales experimentos, el uso de plantas intactas requiere experimentos a largo plazo y protocolos complejos de preparación de muestras que pueden verse afectados por varios factores. Los cultivos de callos vegetales combinados con espectrometría de masas de alta resolución (HRMS) pueden proporcionar una solución para la identificación precisa y rápida de metabolitos de xenobióticos en plantas, ya que pueden evitar la interferencia del microambiente microbiano o fúngico, acortar la duración del tratamiento y simplificar el efecto matriz de las plantas intactas. El 2,4-dibromofenol, un retardante de llama y disruptor endocrino típico, se eligió como sustancia modelo debido a su presencia generalizada en el suelo y a su potencial de absorción por las plantas. En este trabajo, el callo vegetal se generó a partir de semillas de asepsia y se expuso a un medio de cultivo estéril que contenía 2,4-dibromofenol. Los resultados mostraron que se identificaron ocho metabolitos de 2,4-dibromofenol en los tejidos de callos de la planta después de 120 h de incubación. Esto indica que el 2,4-dibromofenol se metabolizó rápidamente en los tejidos callosos de las plantas. Por lo tanto, la plataforma de cultivo de callos vegetales es un método eficaz para evaluar la absorción y el metabolismo de los xenobióticos en las plantas.

Introduction

Un número cada vez mayor de contaminantes orgánicos han sido descartados en el medio ambiente debido a las actividades antropogénicas 1,2, y el suelo se considera un importante sumidero de estos contaminantes 3,4. Los contaminantes del suelo pueden ser absorbidos por las plantas y potencialmente transferidos a organismos de nivel trófico superior a lo largo de las cadenas alimentarias, entrando directamente en el cuerpo humano a través del consumo de cultivos, lo que conduce a una exposición no intencionada 5,6. Las plantas utilizan diferentes vías para metabolizar los xenobióticos para la desintoxicación7; Dilucidar el metabolismo de los xenobióticos es importante, ya que controla el destino real de los contaminantes en las plantas. Dado que los metabolitos pueden ser excretados por las hojas (a la atmósfera) o las raíces, la determinación de los metabolitos en las primeras fases de la exposición ofrece la posibilidad de analizar un número prolongado de metabolitos8. Sin embargo, los estudios con plantas intactas requieren experimentos a largo plazo y protocolos complejos de preparación de muestras que pueden verse afectados por diversos factores.

Los cultivos de callos vegetales, por lo tanto, son una buena alternativa para estudiar el metabolismo de los xenobióticos en planta, ya que pueden acortar en gran medida el tiempo de tratamiento. Estos cultivos excluyen la interferencia microbiana y la degradación fotoquímica, simplifican el efecto matriz de las plantas intactas, estandarizan las condiciones de cultivo y requieren menos esfuerzo experimental. Los cultivos de callos vegetales se han aplicado con éxito como un enfoque alternativo en estudios metabólicos de triclosán9, nonilfenol10 y tebuconazol8. Estos estudios mostraron que los patrones metabólicos en los cultivos de callos eran similares a los de las plantas intactas. Este estudio propone un método para la identificación eficiente y precisa de metabolitos de xenobióticos en plantas sin protocolos complejos y que requieren mucho tiempo. Aquí, utilizamos cultivos de callos vegetales en combinación con espectrometría de masas de alta resolución para el análisis de metabolitos con señales de baja intensidad11,12.

Con este fin, las suspensiones de callos de zanahoria (Daucus carota var. sativus) se expusieron a 100 μg/L de 2,4-dibromofenol durante 120 h en un agitador a 130 rpm y 26 °C. Se eligió el 2,4-dibromofenol debido a su actividad endocrina disruptiva13 y su presencia generalizada en el suelo14. Los metabolitos fueron extraídos y analizados por espectrometría de masas de alta resolución. El protocolo aquí propuesto puede investigar el metabolismo in planta de otros tipos de compuestos orgánicos que pueden ser ionizados.

Protocol

1. Diferenciación del callo de zanahoria NOTA: Autoclave todo el equipo utilizado aquí y realice todas las operaciones en un banco de trabajo ultralimpio esterilizado por UV. Vernalizar las semillas sumergiendo las semillas uniformes de zanahoria (Daucus carota var. sativus) en agua desionizada a 4 °C durante 16 h. Esterilizar las semillas vernalizadas con etanol al 75% durante 20 minutos y luego enjuagar tres veces con agua desionizada estéril…

Representative Results

Los pasos del protocolo se muestran en la Figura 1. Siguiendo el protocolo, comparamos el cromatograma del extracto de callo de zanahoria del tratamiento con 2,4-dibromofenol con los controles, y encontramos ocho picos distintos que están presentes en el tratamiento con 2,4-dibromofenol pero ausentes en los controles (Figura 2). Esto indica que un total de ocho metabolitos de 2,4-dibromofenol (M562, M545, M661, M413, M339, M380, M424 y M187) se detectaron con ?…

Discussion

Este protocolo fue desarrollado para identificar eficientemente la biotransformación de xenobióticos en plantas. El paso crítico de este protocolo es el cultivo del callo de la planta. La parte más difícil es la diferenciación y el mantenimiento del callo de la planta, porque el callo de la planta se infecta fácilmente y se convierte en tejidos vegetales. Por lo tanto, es importante asegurarse de que todos los equipos utilizados estén esterilizados en autoclave y que todas las operaciones se realicen en condicion…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudio contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (21976160) y el Proyecto de Investigación de Aplicación de Tecnología de Bienestar Público (LGF21B070006) de la provincia de Zhejiang.

Materials

2,4-dichlorophenoxyacetic acid WAKO 1 mg/L
20% H2O2 Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 10011218-500ML
4-n-NP, >99% Dr. Ehrenstorfer GmbH
4-n-NP-d4 Pointe-Claire
6-benzylaminopurine WAKO 0.5 mg/L
75% ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 1269101-500ML
7890A-5975 gas chromatography Agilent
ACQULTY ultra-performance liquid chromatography Waters
Amber glass vials Waters
Artificial climate incubator Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,LTD RDN-1000A-4
Autoclaves STIK MJ-Series
C18 column ACQUITY UPLC BEH
Centrifuge Thermo Fisher
DB-5MS capillary column Agilent
Dichloromethane Sigma-Aldrich 40071190-4L
Freeze dryer SCIENTZ 
High-throughput tissue grinder SCIENTZ 
Methanol Sigma-Aldrich
MicrOTOF-QII mass spectrometer Bruker Daltonics
Milli-Q system Millipore MS1922801-4L
Murashige & Skoog medium HOPEBIO HB8469-7
N-hexane Sigma-Aldrich H109658-4L
Nitrogen blowing instrument  AOSHENG MD200-2
NP isomers, >99% Dr. Ehrenstorfer GmbH
Oasis HLB cartridges Waters 60 mg/3 mL
Research plus Eppendorf 100-1000 µL
Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus)  Shouguang Seed Industry Co., Ltd
Shaking Incubators Shanghai bluepard instruments Co.,ltd. THZ-98AB
Solid phase extractor AUTO SCIENCE
Ultrasound machine ZKI UC-6
UV-sterilized ultra-clean workbench AIRTECH

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Cite This Article
Wu, J., Yang, X., Wang, Q., Zhou, Q., Zhang, A., Sun, J. Elucidating the Metabolism of 2,4-Dibromophenol in Plants. J. Vis. Exp. (192), e65089, doi:10.3791/65089 (2023).

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