Summary

Bitkilerde 2,4-Dibromofenol Metabolizmasının Aydınlatılması

Published: February 10, 2023
doi:

Summary

Mevcut protokol, bitkilerde 2,4-dibromofenol metabolitlerinin tanımlanması için basit ve etkili bir yöntemi açıklamaktadır.

Abstract

Toprak, çevreye atılan kirleticiler için önemli bir yutak olduğundan, mahsuller organik kirleticilere yoğun bir şekilde maruz kalabilir. Bu, kirletici birikmiş gıdaların tüketimi yoluyla potansiyel insan maruziyeti yaratır. Bitkilerde ksenobiyotiklerin alımını ve metabolizmasını aydınlatmak, insanlarda diyete maruz kalma riskinin değerlendirilmesi için gereklidir. Bununla birlikte, bu tür deneyler için, bozulmamış bitkilerin kullanımı, çeşitli faktörlerden etkilenebilecek uzun vadeli deneyler ve karmaşık numune hazırlama protokolleri gerektirir. Yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi (HRMS) ile birleştirilmiş bitki kallus kültürleri, mikrobiyal veya fungal mikro ortamdan kaynaklanan parazitleri önleyebildiğinden, tedavi süresini kısaltabildiğinden ve bozulmamış bitkilerin matris etkisini basitleştirebildiğinden, bitkilerde ksenobiyotiklerin metabolitlerinin doğru ve zaman kazandıran tanımlanması için bir çözüm sağlayabilir. Tipik bir alev geciktirici ve endokrin bozucu olan 2,4-dibromofenol, toprakta yaygın olarak bulunması ve bitkiler tarafından alım potansiyeli nedeniyle model madde olarak seçilmiştir. Burada, asepsi tohumlarından bitki kallusu üretildi ve steril 2,4-dibromofenol içeren kültür ortamına maruz bırakıldı. Sonuçlar, 120 saatlik inkübasyondan sonra bitki kallus dokularında sekiz 2,4-dibromofenol metabolitinin tanımlandığını gösterdi. Bu, 2,4-dibromofenolün bitki kallus dokularında hızla metabolize olduğunu gösterir. Bu nedenle, bitki kallus kültürü platformu, bitkilerde ksenobiyotiklerin alımını ve metabolizmasını değerlendirmek için etkili bir yöntemdir.

Introduction

Antropojenik faaliyetler 1,2 nedeniyle artan sayıda organik kirletici çevreye atılmıştırve toprak bu kirleticiler için önemli bir yutak olarak kabul edilmektedir 3,4. Topraktaki kirleticiler bitkiler tarafından alınabilir ve mahsul tüketimi yoluyla doğrudan insan vücuduna girerek gıda zincirleri boyunca potansiyel olarak daha yüksek trofik seviyeli organizmalara aktarılabilir ve sonuç olarak istenmeyen maruziyete yol açabilir 5,6. Bitkiler, detoksifikasyon için ksenobiyotikleri metabolize etmek için farklı yollar kullanır7; Ksenobiyotiklerin metabolizmasını aydınlatmak, bitkilerdeki kirleticilerin gerçek kaderini kontrol ettiği için önemlidir. Metabolitler yapraklar (atmosfere) veya kökler tarafından atılabildiğinden, maruziyetin çok erken aşamalarında metabolitlerin belirlenmesi, bu nedenle çok sayıda metaboliti test etme imkanı sağlar8. Bununla birlikte, bozulmamış bitkiler kullanılarak yapılan çalışmalar, çeşitli faktörlerden etkilenebilecek uzun süreli deneyler ve karmaşık numune hazırlama protokolleri gerektirir.

Bu nedenle bitki kallus kültürleri, tedavi süresini büyük ölçüde kısaltabildikleri için plantadaki ksenobiyotiklerin metabolizmasını incelemek için iyi bir alternatiftir. Bu kültürler mikrobiyal girişimi ve fotokimyasal bozunmayı dışlar, bozulmamış bitkilerin matris etkisini basitleştirir, yetiştirme koşullarını standartlaştırır ve daha az deneysel çaba gerektirir. Bitki kallus kültürleri, triklosan9, nonilfenol10 ve tebukonazol8’in metabolik çalışmalarında alternatif bir yaklaşım olarak başarıyla uygulanmıştır. Bu çalışmalar, kallus kültürlerindeki metabolik modellerin bozulmamış bitkilerdekilere benzer olduğunu göstermiştir. Bu çalışma, karmaşık ve zaman alıcı protokoller olmadan bitkilerde ksenobiyotiklerin metabolitlerinin verimli ve doğru bir şekilde tanımlanması için bir yöntem önermektedir. Burada, düşük yoğunluklu sinyallere sahip metabolitlerin analizi için yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi ile birlikte bitki kallus kültürlerinikullanıyoruz 11,12.

Bu amaçla, havuç (Daucus carota var. sativus) kallus süspansiyonları, 130 rpm ve 26 °C’de bir çalkalayıcıda 120 saat boyunca 100 μg/L 2,4-dibromofenole maruz bırakıldı. 2,4-dibromofenol, yıkıcı endokrin aktivitesi13 ve toprakta yaygın olarak görülmesinedeniyle seçilmiştir 14. Metabolitler ekstrakte edildi ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi ile analiz edildi. Burada önerilen protokol, iyonize olabilen diğer organik bileşik türlerinin bitki metabolizmasını araştırabilir.

Protocol

1. Havuç nasırının farklılaşması NOT: Burada kullanılan tüm ekipmanları otoklavlayın ve tüm işlemleri UV ile sterilize edilmiş ultra temiz bir tezgahta gerçekleştirin. Tek tip havuç tohumlarını (Daucus carota var. sativus) 4 °C’de 16 saat boyunca deiyonize suya batırarak tohumları vernalize edin. Vernalize tohumları 20 dakika boyunca etanol ile yüzey sterilize edin ve ardından aseptik koşullar altında steril deiyonize…

Representative Results

Protokolün adımları Şekil 1’de gösterilmiştir. Protokolü takiben, 2,4-dibromofenol tedavisinden elde edilen havuç kallus ekstraktının kromatogramını kontrollerle karşılaştırdık ve 2,4-dibromofenol tedavisinde bulunan ancak kontrollerde bulunmayan sekiz farklı pik bulduk (Şekil 2). Bu, 2,4-dibromofenol ile muamele edilmiş havuç kallusunda toplam sekiz 2,4-dibromofenol metabolitinin (M562, M545, M661, M413, M339, M380, M424 ve M187) başarıyl…

Discussion

Bu protokol, bitkilerde ksenobiyotiklerin biyodönüşümünü verimli bir şekilde tanımlamak için geliştirilmiştir. Bu protokolün kritik adımı, bitki kallusunun kültürüdür. En zor kısım bitki nasırının farklılaşması ve bakımıdır, çünkü bitki nasırı kolayca enfekte olur ve bitki dokularına gelişir. Bu nedenle, kullanılan tüm ekipmanların otoklavlandığından ve tüm işlemlerin aseptik koşullar altında yapıldığından emin olmak önemlidir. Ototrofik büyüme ve aşırı gelişmeyi ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (21976160) ve Zhejiang Eyaleti Kamu Refahı Teknolojisi Uygulama Araştırma Projesi (LGF21B070006) tarafından desteklenmiştir.

Materials

2,4-dichlorophenoxyacetic acid WAKO 1 mg/L
20% H2O2 Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 10011218-500ML
4-n-NP, >99% Dr. Ehrenstorfer GmbH
4-n-NP-d4 Pointe-Claire
6-benzylaminopurine WAKO 0.5 mg/L
75% ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 1269101-500ML
7890A-5975 gas chromatography Agilent
ACQULTY ultra-performance liquid chromatography Waters
Amber glass vials Waters
Artificial climate incubator Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,LTD RDN-1000A-4
Autoclaves STIK MJ-Series
C18 column ACQUITY UPLC BEH
Centrifuge Thermo Fisher
DB-5MS capillary column Agilent
Dichloromethane Sigma-Aldrich 40071190-4L
Freeze dryer SCIENTZ 
High-throughput tissue grinder SCIENTZ 
Methanol Sigma-Aldrich
MicrOTOF-QII mass spectrometer Bruker Daltonics
Milli-Q system Millipore MS1922801-4L
Murashige & Skoog medium HOPEBIO HB8469-7
N-hexane Sigma-Aldrich H109658-4L
Nitrogen blowing instrument  AOSHENG MD200-2
NP isomers, >99% Dr. Ehrenstorfer GmbH
Oasis HLB cartridges Waters 60 mg/3 mL
Research plus Eppendorf 100-1000 µL
Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus)  Shouguang Seed Industry Co., Ltd
Shaking Incubators Shanghai bluepard instruments Co.,ltd. THZ-98AB
Solid phase extractor AUTO SCIENCE
Ultrasound machine ZKI UC-6
UV-sterilized ultra-clean workbench AIRTECH

References

  1. Chakraborty, P., et al. Baseline investigation on plasticizers, bisphenol A, polycyclic aromatic hydrocarbons and heavy metals in the surface soil of the informal electronic waste recycling workshops and nearby open dumpsites in Indian metropolitan cities. Environmental Pollution. 248, 1036-1045 (2019).
  2. Abril, C., Santos, J. L., Martin, J., Aparicio, I., Alonso, E. Occurrence, fate and environmental risk of anionic surfactants, bisphenol A, perfluorinated compounds and personal care products in sludge stabilization treatments. Science of the Total Environment. 711, 135048 (2020).
  3. Xu, Y. W., et al. Determination and occurrence of bisphenol A and thirteen structural analogs in soil. Chemosphere. 277, 130232 (2021).
  4. Cai, Q. Y., et al. Occurrence of nonylphenol and nonylphenol monoethoxylate in soil and vegetables from vegetable farms in the Pearl River Delta, South China. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 63 (1), 22-28 (2012).
  5. Wang, S. Y., et al. et al Migration and health risks of nonylphenol and bisphenol a in soil-winter wheat systems with long-term reclaimed water irrigation. Ecotoxicology and Environmental Safety. 158, 28-36 (2018).
  6. Gunther, K., Racker, T., Bohme, R. An isomer-specific approach to endocrine-disrupting nonylphenol in infant food. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (6), 1247-1254 (2017).
  7. Van Eerd, L. L., Hoagland, R. E., Zablotowicz, R. M., Hall, J. C. Pesticide metabolism in plants and microorganisms. Weed Science. 51 (4), 472-495 (2003).
  8. Hillebrands, L., Lamshoeft, M., Lagojda, A., Stork, A., Kayser, O. Evaluation of callus cultures to elucidate the metabolism of tebuconazole, flurtamone, fenhexamid, and metalaxyl-M in Brassica napus L., Glycine max (L.) Merr., Zea mays L., and Triticum aestivum L. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (48), 14123-14134 (2020).
  9. Macherius, A., et al. Metabolization of the bacteriostatic agent triclosan in edible plants and its consequences for plant uptake assessment. Environmental Science & Technology. 46 (19), 10797-10804 (2012).
  10. Sun, J. Q., et al. Uptake and metabolism of nonylphenol in plants: Isomer selectivity involved with direct conjugation. Environmental Pollution. 270, 116064 (2021).
  11. Schymanski, E. L., et al. Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence. Environmental Science & Technology. 48 (4), 2097-2098 (2014).
  12. Moschet, C., Anumol, T., Lew, B. M., Bennett, D. H., Young, T. M. Household dust as a repository of chemical accumulation: new insights from a comprehensive high-resolution mass spectrometric study. Environmental Science & Technology. 52 (5), 2878-2887 (2018).
  13. Ren, Z., et al. Hydroxylated PBDEs and brominated phenolic compounds in particulate matters emitted during recycling of waste printed circuit boards in a typical e-waste workshop of South China. Environmental Pollution. 177, 71-77 (2013).
  14. de Wit, C. A. An overview of brominated flame retardants in the environment. Chemosphere. 46 (5), 583-624 (2002).
  15. Sun, J. Q., Chen, Q., Qian, Z. X., Zheng, Y., Yu, S. A., Zhang, A. P. Plant Uptake and Metabolism of e,4-Dibromophenol in Carrot: In Vitro Enzymatic Direct Conjugation. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (17), 4328-4335 (2018).
  16. Chibwe, L., Titaley, I. A., Hoh, E., Simonich, S. L. M. Integrated framework for identifying toxic transformation products in complex environmental mixtures. Environmental Science & Technology Letters. 4 (2), 32-43 (2017).
  17. Hollender, J., Schymanski, E. L., Singer, H. P., Ferguson, P. L. Nontarget screening with high resolution mass spectrometry in the environment: ready to go. Environmental Science & Technology. 51 (20), 11505-11512 (2017).
  18. Nafisi, M., Fimognari, L., Sakuragi, Y. Interplays between the cell wall and phytohormones in interaction between plants and necrotrophic pathogens. Phytochemistry. 112, 63-71 (2015).
  19. Zhang, Q., et al. Multiple metabolic pathways of 2,4,6-tribromophenol in rice plants. Environmental Science & Technology. 53 (13), 7473-7482 (2019).
  20. Hou, X., et al. Glycosylation of tetrabromobisphenol A in pumpkin. Environmental Science & Technology. 53 (15), 8805-8812 (2019).

Play Video

Cite This Article
Wu, J., Yang, X., Wang, Q., Zhou, Q., Zhang, A., Sun, J. Elucidating the Metabolism of 2,4-Dibromophenol in Plants. J. Vis. Exp. (192), e65089, doi:10.3791/65089 (2023).

View Video