Summary

Ensayo de viabilidad de conidios de Trichoderma stromaticum dentro de macrófagos mononucleares derivados de sangre periférica humana

Published: October 20, 2023
doi:

Summary

La técnica que implica la fagocitosis de conidios fúngicos por macrófagos es ampliamente utilizada para estudios que evalúan la modulación de las respuestas inmunes contra hongos. El propósito de este manuscrito es presentar un método para evaluar la fagocitosis y la capacidad de depuración de macrófagos mononucleares de sangre periférica humana estimulados con conidios de Trichoderma stromaticum .

Abstract

Los macrófagos representan una línea de defensa crucial y son responsables de prevenir el crecimiento y la colonización de patógenos en diferentes tejidos. La fagocitosis conidial es un proceso clave que permite la investigación de los eventos citoplasmáticos y moleculares implicados en las interacciones macrófago-patógeno, así como la determinación del momento de muerte de los conidios internalizados. La técnica que implica la fagocitosis de conidios fúngicos por macrófagos es ampliamente utilizada para estudios que evalúan la modulación de las respuestas inmunes contra hongos. La evasión de la fagocitosis y el escape de los fagosomas son mecanismos de virulencia fúngica. En este trabajo se presentan los métodos que se pueden utilizar para el análisis de la fagocitosis, aclaramiento y viabilidad de T. stromaticum conidia, un hongo que se utiliza como agente de biocontrol y biofertilizante y es capaz de inducir infecciones humanas. El protocolo consiste en 1) cultivo de Trichoderma , 2) lavado para obtener conidios, 3) el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) utilizando el método de solución de polisacarosa y la diferenciación de los PBMCs en macrófagos, 4) un método de fagocitosis in vitro utilizando cubreobjetos de vidrio redondos y coloración, y 5) un ensayo de aclaramiento para evaluar la viabilidad de los conidios después de la fagocitosis de los conidios. En resumen, estas técnicas se pueden utilizar para medir la eficiencia de eliminación de hongos de los macrófagos.

Introduction

El género Trichoderma (Orden: Hypocreales, Familia: Hypocreaceae) está compuesto por hongos saprófitos ubicuos que son parásitos de otras especies fúngicas y son capaces de producir una variedad deenzimas comercialmente útiles. Estas especies fúngicas se utilizan para la producción de proteínas heterólogas2, la producción de celulosa3, etanol, cerveza, vino y papel4, en la industria textil5, la industria alimentaria6 y en la agricultura como agentes de control biológico 7,8. Además del interés industrial en estas especies fúngicas, el creciente número de infecciones en humanos ha dado a algunas especies de Trichoderma el estatus de patógenos oportunistas9.

Trichoderma spp. crece rápidamente en cultivo, con colonias inicialmente blancas y algodonosas que se vuelven de color amarillo verdoso a verde oscuro10. Están adaptados a vivir en un amplio rango de condiciones de pH y temperatura, y las especies oportunistas son capaces de sobrevivir a pH y temperaturas fisiológicas y, por lo tanto, colonizar diferentes tejidos humanos 11,12,13. Es importante destacar que el aumento en la tasa de infección de Trichoderma spp. puede estar asociado con factores de virulencia, y estos no están bien estudiados. Además, los estudios centrados en la comprensión de la respuesta inmunitaria contra especies oportunistas de Trichoderma siguen siendo escasos.

Durante una infección, junto con los neutrófilos, los macrófagos representan la línea de defensa responsable de la fagocitosis y, por lo tanto, evitan el crecimiento y la colonización de patógenos en diferentes tejidos. Utilizando receptores de reconocimiento de patrones, como los receptores tipo Toll y los receptores de lectina de tipo C, los macrófagos fagocitan hongos y los procesan en fagolisosomas, promoviendo así un estallido respiratorio, la liberación de citoquinas proinflamatorias y la destrucción de los microorganismos fagocitados14. El mecanismo de fagocitosis, sin embargo, puede verse afectado y evadido por diferentes estrategias microbianas, como el tamaño y la forma de las células fúngicas; la presencia de cápsulas que dificultan la fagocitosis; disminuir el número de receptores inductores de fagocitosis; la remodelación de la estructura de las fibras de actina en el citoplasma; dificultar la formación de seudópodos; y el escape de fagosomas o fagolisosomas después del proceso de fagocitosis14.

Muchos patógenos, incluido Cryptococcus neoformans, utilizan los macrófagos como nicho para sobrevivir en el huésped, diseminarse e inducir la infección15. El ensayo de fagocitosis y aclaramiento se utiliza para evaluar la respuesta inmune frente a patógenos e identificar las estrategias microbianas empleadas para evadir el sistema inmune innato 15,16,17. Este tipo de técnica también se puede utilizar para examinar la cinética diferencial de la fagocitosis, la acidificación retardada del fagosoma y el estallido oxidativo que dan lugar a una reducción de la muerte fúngica18.

Se pueden utilizar diferentes métodos para evaluar la fagocitosis, la supervivencia fúngica y la evasión del proceso de maduración del fagosoma. Entre ellas se encuentran la microscopía de fluorescencia, que se utiliza para observar la fagocitosis, la ubicación celular y las moléculas producidas durante la fagocitosis19; citometría de flujo, que proporciona datos cuantitativos sobre la fagocitosis y se utiliza para evaluar los diferentes marcadores implicados en el proceso20,21; microscopía intravital, que se utiliza para evaluar la captura microbiana y la maduración del fagosoma22; fagocitosis mediada por anticuerpos, que se utiliza para evaluar la especificidad del proceso de fagocitosis de un patógeno23; y otros 24,25,26,27.

El protocolo presentado aquí emplea un método común, de bajo costo y directo que utiliza un microscopio óptico y un ensayo de crecimiento en placa para evaluar la fagocitosis y la eliminación de los conidios fúngicos. Este protocolo proporcionará a los lectores instrucciones paso a paso para realizar el ensayo de fagocitosis y aclaramiento utilizando macrófagos mononucleares derivados de sangre periférica humana expuestos a T. stromaticum. Los PBMC se utilizaron porque los conidios de Trichoderma se aplican como biocontrol contra fitopatógenos y biofertilizante para cultivos de plantas en todo el mundo y han causado varias infecciones humanas, llamadas Trichodermosis. Además, solo hay dos trabajos previos centrados en la interacción entre los conidios de Trichoderma y el sistema inmune humano, en los que examinamos los neutrófilos28 y la autofagia en macrófagos29. Este artículo muestra, en primer lugar, cómo se puede estudiar la fagocitosis de los conidios de T. stromaticum por macrófagos derivados de PBMC, y luego cómo se puede evaluar la viabilidad de los conidios engullidos utilizando técnicas simples basadas en microscopía. Este protocolo puede facilitar aún más las investigaciones sobre la respuesta inmunitaria asociada a macrófagos o los mecanismos relacionados con la modulación del sistema inmunitario.

Protocol

Consideraciones éticas y sujetos humanosTodos los experimentos con seres humanos descritos en este estudio fueron realizados de acuerdo con la Declaración de Helsinki y las leyes federales brasileñas y aprobados por el Comité de Ética de la Universidad Estadual de Santa Cruz (código de identificación del proyecto: 550.382/ 2014). Se colectó sangre periférica humana de voluntarios sanos de la ciudad de Ilhéus, Bahía, Brasil, no expuestos a actividades ocupacional…

Representative Results

La técnica que implica la fagocitosis de conidios fúngicos por macrófagos es ampliamente utilizada para estudios que evalúan la modulación de las respuestas inmunes contra hongos. Utilizamos la fagocitosis de los conidios de T. stromaticum para evaluar la viabilidad de los conidios después de la fagocitosis, ya que la evasión de la fagocitosis y el escape de los fagosomas son mecanismos de virulencia fúngica. Los investigadores deben realizar estas técnicas como uno de los primeros ensayos cuando se inv…

Discussion

Para varios patógenos fúngicos, incluyendo Aspergillus fumigatus, Cryptococcus, Candida albicans y otros, la fagocitosis conidial o de levadura es un proceso clave que permite la investigación de los eventos citoplasmáticos y moleculares en las interacciones macrófago-patógeno, así como la determinación del momento de muerte de los conidios internalizados 14,39,40. La fagocitosis es el proceso …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo contó con el apoyo de las siguientes instituciones financieras brasileñas: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) con subvenciones RED0011/2012 y RED008/2014. U.R.S., J.O.C. y M.E.S.M. reconocen la beca otorgada por la Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) y la FAPESB, respectivamente.

Materials

15 mL centrifuge tubes Corning CLS431470 15 mL centrifuge tubes, polypropylene, conical bottom with lid, individually sterile
24-Well Flat Bottom Cell Culture Plate Kasvi K12-024 Made of polystyrene with alphanumeric identification; The Cell Culture Plate is DNase, RNase and pyrogen-free and free of cytotoxic substances; Sterilized by gamma radiation;
Cell culture CO2 incubator Sanyo 303082 A CO2 incubator serves to create and control conditions similar to a human body, thus allowing the in vitro growth and proliferation of different cell types.
Centrifuge Microtube (eppendorf type) 1.5 mL Capp 5101500 Made from polypropylene, with a cap attached to the tube for opening and closing with just one hand. It has a polished interior against protein adhesion and for sample visibility, being free of DNase, RNase and Pyrogens
Circular coverslip 15 mm Olen K5-0015 Circular coverslips are used for microscopy techniques in cell culture. Made of super transparent translucent glass; with thickness of 0.13 mm
Class II Type B2 (Total Exhaust) Biosafety Cabinets Esco Lifesciences group 2010274 Airstream Class II Type B2 Biosafety Cabinets (AB2) provide product, operator and environmental protection and are suitable for work with trace amounts of toxic chemicals and agents assigned to biological safety levels I, II or III. In a Class II Type B2 cabinet, all inflow and downflow air is exhausted after HEPA/ULPA filtration to the external environment without recirculation across the work surface.
Dextrose Potato Agar medium Merck 145 Potato Dextrose Agar is used in the cultivation and enumeration of yeasts and fungi
EDTA vacuum blood collection tube FirstLab FL5-1109L EDTA is the recommended anticoagulant for hematology routines as it is the best anticoagulant for preserving cell morphology.
Entellan Merck 1.07961  Fixative agent; Entellan is a waterless mounting medium for permanent mounting for microscopy.
Fetal Bovine Serum Gibco A2720801 Fetal bovine serum (FBS) is a universal growth supplement of cell and tissue culture media. FBS is a natural cocktail of most of the factors required for cell attachment, growth, and proliferation, effective for most types of human and animal (including insect) cells.
Flaticon  database of images
Glycerol Merck 24900988 The cryoprotectant agent glycerol is used for freezing cells and spores
Histopaque-1077 polysucrose solution
Image J  Image analysis software
Microscopy slides Precision 7105 Slide for Microscopy 26 x 76 mm Matte Lapped Thickness 1.0 to 1.2 mm. Made of special optical glass and packaged with silk paper divider with high quality transparency free of imperfections
Mini centrifuge Prism C1801 The Prism Mini Centrifuge was designed to be extremely compact with an exceptionally small footprint. Includes 2 interchangeable quick-release rotors that spin up to 6000 rpm. An electronic brake provides quick deceleration and the self-opening lid allows easy access to the sample, reducing handling time.
Neubauer chamber Kasvi K5-0011 The Neubauer Counting Chamber is used for counting cells or other suspended particles.
Panoptic fast  Laborclin 620529 Laborclin's  panoptic fast c is a kit for quick staining in hematology
Penicillin/Streptomycin Solution – 10,000U LGC- Biotechnology  BR3011001 antibiotic is used in order to avoid possible contamination by manipulation external to the laminar flow.
Petri dish 90 x 15 mm Smooth Cralplast 18248 Disposable Petri dish; Made of highly transparent polystyrene (PS); flat bottom; Smooth;Size: 90 x 15 mm.
Phosphate buffered saline (PBS) thermo fisher Scientific 10010001 PBS is a water-based saline solution with a simple formulation. It is isotonic and non-toxic to most cells. It includes sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock while maintaining the water balance of living cells.
Pipette Pasteur 3 mL Sterile Accumax AP-3-B-S STERILE ACCUMAX PASTEUR 3 ML PIPETTE with 3 mL capacity, made of transparent low-density polyethylene (LDPE) and individually sterile
Refrigerated Centrifuge Thermo Scientific TS-HM16R The Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R Refrigerated Centrifuge is a refrigerated centrifuge with the user-friendly control panel makes it easy to pre-set the speed, RCF value, running time, temperature, and running profile. The Megafuge 16R can reach maximum speeds of 15,200 RPM and maximum RCF of 25,830 x g.
RPMI-1640 Medium Merck MFCD00217820 HEPES Modification, with L-glutamine and 25 mM HEPES, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture
The single channel micropipettes Eppendorf Z683809 Single-channel micropipettes are used to accurately transfer and measure very small amounts of liquids.
Tip for Micropipettor Corning 4894 Capacity of 10 µL and 1,000 µL Autoclavable
Triocular inverted microscope LABOMED VU-7125500 It allows you to observe cells inside tubes and bottles, without having to open them, thus avoiding contamination problems.

References

  1. Samuels, G. J. Trichoderma: A review of biology and systematics of the genus. Mycological Research. 100 (8), 923-935 (1996).
  2. Nevalainen, H., Peterson, R., Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. Chapter 7 – Heterologous expression of proteins in Trichoderma. Biotechnology and Biology of Trichoderma. , (2014).
  3. Do Vale, L. H. F., Filho, E. X. F., Miller, R. N. G., Ricart, C. A. O., de Sousa, M. V., Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. Chapter 16 – Cellulase systems in Trichoderma: An overview. Biotechnology and Biology of Trichoderma. , (2014).
  4. Ferreira, N. L., Margeot, A., Blanquet, S., Berrin, J. G., Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. Chapter 17 – Use of cellulases from Trichoderma reesei in the twenty-first century part I: Current industrial uses and future applications in the production of second ethanol generation. Biotechnology and Biology of Trichoderma. , (2014).
  5. Puranen, T., Alapuranen, M., Vehmaanperä, J., Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. Chapter 26 – Trichoderma enzymes for textile industries. Biotechnology and Biology of Trichoderma. , (2014).
  6. Kunamneni, A., Plou, F. J., Alcalde, M., Ballesteros, A., Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. Chapter 24 – Trichoderma enzymes for food industries. Biotechnology and Biology of Trichoderma. , (2014).
  7. Mukherjee, P. K., Horwitz, B. A., Herrera-Estrella, A., Schmoll, M., Kenerley, C. M. Trichoderma research in the genome era. Annual Review of Phytopathology. 51 (1), 105-129 (2013).
  8. Mukherjee, M., et al. Trichoderma-plant-pathogen interactions: Advances in genetics of biological control. Indian Journal of Microbiology. 52 (4), 522-529 (2012).
  9. dos Santos, U. R., dos Santos, J. L. Trichoderma after crossing kingdoms: Infections in human populations. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B. 26 (2), 97-126 (2023).
  10. Asis, A., et al. Identification patterns of Trichoderma strains using morphological characteristics, phylogenetic analyses and lignocellulolytic activities. Molecular Biology Reports. 48 (4), 3285-3301 (2021).
  11. Antal, Z., et al. Comparative study of potential virulence factors in human pathogenic and saprophytic Trichoderma longibrachiatum strains. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. 52 (3-4), 341-350 (2005).
  12. Hatvani, L., Manczinger, L., Vágvölgyi, C., Kredics, L., Mukherjee, P. K., Horwitz, B. A., Singh, U. S., Mukherjee, M., Schmoll, M. Trichoderma as a human pathogen. Trichoderma: Biology and Applications. , (2013).
  13. Kredics, L., et al. Clinical importance of the genus Trichoderma: A review. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. 50 (2-3), 105-117 (2003).
  14. Erwig, L. P., Gow, N. A. R. Interactions of fungal pathogens with phagocytes. Nature Reviews Microbiology. 14 (3), 163-176 (2016).
  15. Nicola, A. M., Casadevall, A. In vitro measurement of phagocytosis and killing of Cryptococcus neoformans by macrophages. Methods in Molecular Biology. 844, 189-197 (2012).
  16. Medina, E., Goldmann, O. In vivo and ex vivo protocols for measuring the killing of extracellular pathogens by macrophages. Current Protocols in Immunology. , 1-17 (2011).
  17. Drevets, D. A., Canono, B. P., Campbell, P. A. Measurement of bacterial ingestion and killing by macrophages. Current Protocols in Immunology. 109, 1-17 (2015).
  18. Gresnigt, M. S., et al. Differential kinetics of Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus phagocytosis. Journal of Innate Immunity. 10 (2), 145-160 (2018).
  19. Steinberg, B. E., Grinstein, S. Analysis of macrophage phagocytosis: Quantitative assays of phagosome formation and maturation using high-throughput fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 531, 45-56 (2009).
  20. Yan, Q., Ahn, S. H., Fowler, V. G. Macrophage phagocytosis assay of Staphylococcus aureus by flow cytometry. Bio-Protocol. 5 (4), 1406 (2015).
  21. Marr, K. A., Koudadoust, M., Black, M. Early events in macrophage killing of Aspergillus fumigatus conidia New flow cytometric viability assay. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1240-1247 (2001).
  22. Surewaard, B. G. J., Kubes, P. Measurement of bacterial capture and phagosome maturation of Kupffer cells by intravital microscopy. Methods. 128, 12-19 (2017).
  23. Siggins, M. K., et al. Differential timing of antibody-mediated phagocytosis and cell-free killing of invasive African Salmonella allows immune evasion. European Journal of Immunology. 44 (4), 1093-1098 (2014).
  24. Cannon, G. J., Swanson, J. A. The macrophage capacity for phagocytosis. Journal of Cell Science. 101 (4), 907-913 (1992).
  25. Harvath, L., Terle, D. A. Assay for phagocytosis. Methods in Molecular Biology. 115, 281-290 (1999).
  26. dos Santos, A. G., et al. Trichoderma asperelloides spores downregulate dectin1/2 and TLR2 receptors of mice macrophages and decrease Candida parapsilosis phagocytosis independent of the M1/M2 polarization. Frontiers in Microbiology. 8, 1681 (2017).
  27. Souza, J. A. M., et al. Characterization of Aspergillus fumigatus extracellular vesicles and their effects on macrophages and neutrophils functions. Frontiers in Microbiology. 10, 2008 (2019).
  28. Oliveira-Mendonça, L. S., et al. Inhibition of extracellular traps by spores of Trichoderma stromaticum on neutrophils obtained from human peripheral blood. Molecular Immunology. 141, 43-52 (2022).
  29. Oliveira-Mendonça, L. S., et al. Trichoderma stromaticum spores induce autophagy and downregulate inflammatory mediators in human peripheral blood-derived macrophages. Current Research in Microbial Sciences. 3, 100145 (2022).
  30. Johnston, L., Harding, S. A., La Flamme, A. C. Comparing methods for ex vivo characterization of human monocyte phenotypes and in vitro responses. Immunobiology. 220 (12), 1305-1310 (2015).
  31. Abedon, S. T., Bartom, E., Maloy, S., Hughes, K. Multiplicity of infection. Brenner’s Encyclopedia of Genetics. Second Edition. , (2013).
  32. Rios, F. J., Touyz, R. M., Montezano, A. C. Isolation and differentiation of human macrophages. Methods in Molecular Biology. 1527, 311-320 (2017).
  33. Lombard, Y., Giaimis, J., Makaya-Kumba, M., Fonteneau, P., Poindron, P. A new method for studying the binding and ingestion of zymosan particles by macrophages. Journal of Immunological Methods. 174 (1-2), 155-165 (1994).
  34. Ghoneum, M., Gollapudi, S. Phagocytosis of Candida albicans by metastatic and non metastatic human breast cancer cell lines in vitro. Cancer Detection and Prevention. 28 (1), 17-26 (2004).
  35. Nunes, J. P. S., Dias, A. A. M. ImageJ macros for the user-friendly analysis of soft-agar and wound-healing assays. BioTechniques. 62 (4), 175-179 (2017).
  36. Alves-Filho, E. R., et al. The biocontrol fungus Trichoderma stromaticum downregulates respiratory burst and nitric oxide in phagocytes and IFN-gamma and IL-10. Journal of Toxicology and Environmental Health – Part A: Current Issues. 74 (14), 943-958 (2011).
  37. Slesiona, S., et al. Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages. PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).
  38. Johnston, S. A., May, R. C. Cryptococcus interactions with macrophages: Evasion and manipulation of the phagosome by a fungal pathogen. Cellular Microbiology. 15 (3), 403-411 (2013).
  39. Alonso, M. F., et al. The nature of the fungal cargo induces significantly different temporal programmes of macrophage phagocytosis. The Cell Surface. 8, 100082 (2022).
  40. Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. Interaction of phagocytes with filamentous fungi. Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).
  41. Dos Santos, U. R., et al. Exposition to biological control agent Trichoderma stromaticum increases the development of cancer in mice injected with murine melanoma. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 252 (2020).
  42. Wang, G., et al. Exopolysaccharide from Trichoderma pseudokoningii induces macrophage activation. Carbohydrate Polymers. 149, 112-120 (2016).
  43. Xu, Y., et al. Exopolysaccharide from Trichoderma pseudokoningii promotes maturation of murine dendritic cells. International Journal of Biological Macromolecules. 92, 1155-1161 (2016).
  44. Schmoll, M., Esquivel-Naranjo, E. U., Herrera-Estrella, A. Trichoderma in the light of day – Physiology and development. Fungal Genetics and Biology. 47 (11), 909-916 (2010).
  45. Zhang, G., Li, D. Trichoderma longibrachiatum-associated skin inflammation and atypical hyperplasia in mouse. Frontiers in Medicine. 9, 865722 (2022).
  46. Paredes, K., Capilla, J., Mayayo, E., Guarro, J. Virulence and experimental treatment of Trichoderma longibrachiatum, a fungus refractory to treatment. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (8), 5029-5032 (2016).
  47. Perkhofer, S., Speth, C., Dierich, M. P., Lass-Flörl, C. In vitro determination of phagocytosis and intracellular killing of Aspergillus species by mononuclear phagocytes. Mycopathologia. 163 (6), 303-307 (2007).

Play Video

Cite This Article
dos Santos, U. R., de Castro, J. O., Santos Matos, M. E., De Bonis, G., dos Santos, J. L. Viability Assay of Trichoderma stromaticum Conidia Inside Human Peripheral Blood Mononuclear-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (200), e65231, doi:10.3791/65231 (2023).

View Video