Dit protocol schetst het gebruik van Agrobacterium tumefaciens-gemedieerde transformatie (AMT) voor het integreren van gen(en) van belang in het nucleaire genoom van de groene microalg Chlorella vulgaris, wat leidt tot de productie van stabiele transformatoren.
Agrobacterium tumefaciens-gemedieerde transformatie (AMT) dient als een veelgebruikt hulpmiddel voor het manipuleren van plantengenomen. A. tumefaciens vertoont echter het vermogen tot genoverdracht naar een breed scala aan soorten. Talloze soorten microalgen missen gevestigde methoden om genen die van belang zijn betrouwbaar te integreren in hun nucleaire genoom. Om de potentiële voordelen van microalgenbiotechnologie te benutten, zijn eenvoudige en efficiënte hulpmiddelen voor genoommanipulatie cruciaal. Hierin wordt een geoptimaliseerd AMT-protocol gepresenteerd voor de industriële microalgensoort Chlorella vulgaris, waarbij gebruik wordt gemaakt van het reporter groen fluorescerend eiwit (mGFP5) en de antibioticaresistentiemarker voor Hygromycine B. Mutanten worden geselecteerd door middel van plating op Tris-Acetaat-Fosfaat (TAP) media die Hygromycine B en cefotaxime bevatten. De expressie van mGFP5 wordt gekwantificeerd via fluorescentie na meer dan tien generaties subculturing, wat wijst op de stabiele transformatie van de T-DNA-cassette. Dit protocol maakt het mogelijk om in minder dan twee weken op betrouwbare wijze meerdere transgene C. vulgaris-kolonies te genereren, waarbij gebruik wordt gemaakt van de in de handel verkrijgbare pCAMBIA1302 plantenexpressievector.
Agrobacterium tumefaciens, een gramnegatieve bodembacterie, bezit een uniek vermogen tot genoverdracht tussen koninkrijken, waardoor het de titel “natuurlijke genetische ingenieur” heeft gekregen1. Deze bacterie kan DNA (T-DNA) overbrengen van een tumor-inducerend plasmide (Ti-Plasmide) naar gastheercellen via een Type IV-secretiesysteem, wat resulteert in de integratie en expressie van het T-DNA in het gastheergenoom 1,2,3,4. In de natuurlijke omgeving leidt dit proces tot tumorvorming in planten, algemeen bekend als kroongalziekte. Agrobacterium kan echter ook T-DNA overbrengen naar verschillende andere organismen, waaronder gist, schimmels, algen, zee-egelembryo’s en zelfs menselijke cellen onder laboratoriumomstandigheden 5,6,7,8.
Door gebruik te maken van dit natuurlijke systeem, maakt Agrobacterium tumefaciens-gemedieerde transformatie (AMT) de willekeurige integratie van gen(en) van belang in het nucleaire genoom van een gastheercel mogelijk door het T-DNA-gebied van het Ti-plasmide te wijzigen. Voor dit doel is een veelgebruikte AMT-plantenexpressievector pCAMBIA13029. Onderzoekers kunnen eenvoudige kloonworkflows gebruiken in E. coli voordat ze de gewenste vector overbrengen naar A. tumefaciens voor latere overdracht naar de gastheer van belang.
Groene microalgen zijn eukaryoten die veel overeenkomsten vertonen met landplanten, maar zeer recalcitrant zijn voor genetische modificatie. Genetische transformatie speelt echter een cruciale rol in zowel fundamenteel als biotechnologisch onderzoek naar microalgen. In verschillende microalgensoorten, met name Chlamydomonas reinhardtii, heeft genetische transformatie via AMT met succes transgenen geïntroduceerd zoals humaan interleukine-2 (hIL-2), het ernstige acute respiratoire syndroom coronavirus 2-receptorbindende domein (SARS-CoV-2 RBD) en twee antimicrobiële peptiden (AMP’s)10,11,12,13. Chlorella vulgaris, een minder kieskeurige en snelgroeiende groene algensoort, heeft een aanzienlijk potentieel voor de duurzame productie van koolhydraten, eiwitten, nutraceuticals, pigmenten en andere hoogwaardigeverbindingen14. Het gebrek aan betrouwbare instrumenten voor het creëren van transgene stammen van C. vulgaris belemmert echter de commerciële vooruitgang ervan. Aangezien er slechts een beperkt aantal gepubliceerde werken zijn gepubliceerd waarin AMT in C. vulgaris15 wordt gebruikt, en gezien de aanzienlijke verschillen tussen de kweek van planten en microalgen, wordt het optimaliseren van het AMT-protocol essentieel.
In deze studie plaatsten onderzoekers groen fluorescerend eiwit (mGFP5) stroomafwaarts van de Cauliflower Mosaic Virus (CamV) 35S-promotor en voegden een histidine-tag toe om het te gebruiken als een reporter-gen voor eiwitexpressie. Transformanten werden geselecteerd met behulp van hygromycine B en na meer dan twintig generaties subculturatie bleef de transformatie stabiel. Het pCAMBIA1302-plasmide dat in dit werk wordt gebruikt, kan gemakkelijk worden aangepast om elk interessant gen te bevatten. Bovendien kunnen de gepresenteerde methode en materialen worden aangepast voor andere groene algensoorten met een actieve CamV35S-promotor, aangezien deze promotor wordt gebruikt voor hygromycineselectie.
De efficiëntie van transformatie wordt geassocieerd met verschillende parameters. De keuze van A. tumefaciens-stammen die voor AMT worden gebruikt, is cruciaal. AGL-1 is een van de meest invasieve stammen die is ontdekt en wordt om deze reden routinematig gebruikt in AMT van planten. Het aanvullen van de inductiemedia met glucose (15-20 mM) is ook belangrijk voor de AMT-efficiëntie. Aangezien C. vulgaris kan groeien in zowel fototrofe als heterotrofe omstandigheden, worden glucose of andere koolstofbr…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen Prof. Paul Hooykaas bedanken voor het beschikbaar stellen van de pCAMBIA1302 vector en Agrobacterium tumefaciens AGL1 van het Instituut Biologie Leiden, Universiteit Leiden, Nederland. De auteurs willen ook Eva Colic bedanken voor haar hulp bij het kweken van de fluorescerende transformatoren. Dit werk werd gefinancierd door de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada en het Mitacs Accelerate-programma.
1 Kb Plus DNA ladder | FroggaBio | DM015 | |
Acetosyringone | Fisher Scientific | D26665G | |
Agrobacterium tumefaciens | Gold Biotechnologies | Strain: AGL-1; Gift from Prof. Paul Hooykaas | Genotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA |
Biotin | Enzo Life Sciences | 89151-400 | |
CaCl2·2H2O | VWR | BDH9224-1KG | |
Cefotaxime | AK Scientific | J90010 | |
Chlorella vulgaris | University of Texas at Austin Culture Collection of Algae | Strain: UTEX 395 | Wildtype strain |
CoCl2·6H2O | Sigma Aldrich | C8661-25G | |
CuSO4·5H2O | EMD Millipore | CX2185-1 | |
FeCl3·6H2O | VWR | BDH9234-500G | |
Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 1652662 | Main unit equipped with PC module. |
GeneJET Plant Genome Purification Kit | Thermo Scientific | K0791 | |
Glacial acetic acid | VWR | CABDH3093-2.2P | |
Glycerol | BioBasic | GB0232 | |
HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H-3375 | |
Hygromycin B | Fisher Scientific | AAJ6068103 | |
K2HPO4 | VWR | BDH9266-500G | |
Kanamycin | Gold Biotechnologies | K-250-25 | |
KH2PO4 | VWR | BDH9268-500G | |
MgSO4·7H2O | VWR | 97062-134 | |
MnCl2·4H2O | JT Baker | BAKR2540-01 | |
Na2CO3 | VWR | BDH7971-1 | |
Na2EDTA·2H2O | JT Baker | 8993-01 | |
Na2MoO4·2H2O | JT Baker | BAKR3764-01 | |
NaCl | VWR | BDH7257-7 | |
NaH2PO4 H2O | Millipore Sigma | CA80058-650 | |
NaNO3 | VWR | BDH4574-500G | |
NEBExpress Ni Resin | NewEngland BioLabs | NEB #S1427 | |
NH4Cl | VWR | BDH9208-500G | |
pCAMBIA1302 | Leiden University | Gift from Prof. Paul Hooykaas | pBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator) |
Polypropylene Columns (5 mL) | QIAGEN | 34964 | |
Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mL | Bio-Rad | 1610363 | |
Rifampicin | Millipore Sigma | R3501-1G | |
SunBlaster LED Strip Light 48 Inch | SunBlaster | 210000000906 | |
Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer | BioTEK | S4MLFPTA | |
Tetracycline | Thermo Scientific Chemicals | CAAAJ61714-14 | |
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | 1610185 | |
Thiamine | TCI America | T0181-100G | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
Tryptone | BioBasic | TG217(G211) | |
Vitamin B12 (cyanocobalamin) | Enzo Life Sciences | 89151-436 | |
Yeast Extract | BioBasic | G0961 | |
ZnSO4·7H2O | JT Baker | 4382-01 |