Agrobacterium tumefaciens-Médié par le génie génétique des microalgues vertes, Chlorella vulgaris
Summary
Ce protocole décrit l’utilisation de la transformation médiée par Agrobacterium tumefaciens (AMT) pour intégrer le(s) gène(s) d’intérêt dans le génome nucléaire de la microalgue verte Chlorella vulgaris, conduisant à la production de transformants stables.
Abstract
La transformation médiée par Agrobacterium tumefaciens (AMT) est un outil largement utilisé pour manipuler les génomes des plantes. Cependant, A. tumefaciens présente la capacité de transférer des gènes à un large éventail d’espèces. De nombreuses espèces de microalgues ne disposent pas de méthodes bien établies pour intégrer de manière fiable les gènes d’intérêt dans leur génome nucléaire. Pour exploiter les avantages potentiels de la biotechnologie des microalgues, des outils de manipulation du génome simples et efficaces sont essentiels. Dans ce document, un protocole AMT optimisé est présenté pour l’espèce de microalgue industrielle Chlorella vulgaris, en utilisant la protéine fluorescente verte rapporteuse (mGFP5) et le marqueur de résistance aux antibiotiques pour l’hygromycine B. Les mutants sont sélectionnés par placage sur un milieu de tris-acétate-phosphate (TAP) contenant de l’hygromycine B et du céfotaxime. L’expression de mGFP5 est quantifiée par fluorescence après plus de dix générations de sous-culture, ce qui indique la transformation stable de la cassette d’ADN-T. Ce protocole permet de générer de manière fiable plusieurs colonies transgéniques de C. vulgaris en moins de deux semaines, en utilisant le vecteur d’expression végétale pCAMBIA1302 disponible dans le commerce.
Introduction
Agrobacterium tumefaciens, une bactérie à Gram négatif transmise par le sol, possède une capacité unique de transfert de gènes entre règnes, ce qui lui a valu le titre d’« ingénieur génétique naturel »1. Cette bactérie peut transférer l’ADN (ADN-T) d’un plasmide inducteur de tumeur (Ti-Plasmide) dans les cellules hôtes par le biais d’un système de sécrétion de type IV, ce qui entraîne l’intégration et l’expression de l’ADN-T dans le génome de l’hôte 1,2,3,4. Dans le cadre naturel, ce processus conduit à la formation de tumeurs chez les plantes, communément appelée maladie de la galle du collet. Cependant, Agrobacterium peut également transférer l’ADN-T dans divers autres organismes, y compris les levures, les champignons, les algues, les embryons d’oursins et même les cellules humaines dans des conditions de laboratoire 5,6,7,8.
Exploitant ce système naturel, la transformation médiée par Agrobacterium tumefaciens (AMT) permet l’intégration aléatoire de gènes d’intérêt dans le génome nucléaire d’une cellule hôte en modifiant la région de l’ADN-T du plasmide Ti. À cette fin, un vecteur d’expression de l’AMT largement utilisé est pCAMBIA13029. Les chercheurs peuvent utiliser des processus de clonage simples chez E. coli avant de transférer le vecteur souhaité dans A. tumefaciens pour un transfert ultérieur à l’hôte d’intérêt.
Les microalgues vertes sont des eucaryotes qui partagent de nombreuses similitudes avec les plantes terrestres mais qui sont très récalcitrantes aux modifications génétiques. Cependant, la transformation génétique joue un rôle crucial dans la recherche fondamentale et biotechnologique sur les microalgues. Chez plusieurs espèces de microalgues, en particulier Chlamydomonas reinhardtii, la transformation génétique via l’AMT a permis d’introduire avec succès des transgènes tels que l’interleukine-2 humaine (hIL-2), le domaine de liaison au récepteur du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2 RBD) et deux peptides antimicrobiens (AMP)10,11,12,13. Parmi celles-ci, Chlorella vulgaris, une espèce d’algue verte moins exigeante et à croissance rapide, présente un potentiel important pour la production durable de glucides, de protéines, de nutraceutiques, de pigments et d’autres composés de grande valeur14. Cependant, le manque d’outils fiables pour créer des souches transgéniques de C. vulgaris entrave son progrès commercial. Étant donné qu’il n’y a eu qu’un nombre limité de travaux publiés utilisant l’AMT chez C. vulgaris15, et compte tenu des différences considérables entre la culture des plantes et celle des microalgues, l’optimisation du protocole AMT devient essentielle.
Dans cette étude, les chercheurs ont inséré une protéine fluorescente verte (mGFP5) en aval du promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CamV) et ont ajouté un marqueur d’histidine pour l’utiliser comme gène rapporteur pour l’expression des protéines. Les transformants ont été sélectionnés à l’aide de l’hygromycine B, et après une sous-culture pendant plus de vingt générations, la transformation est restée stable. Le plasmide pCAMBIA1302 utilisé dans ce travail peut être facilement adapté pour contenir n’importe quel gène d’intérêt. De plus, la méthode et les matériaux présentés peuvent être ajustés pour d’autres espèces d’algues vertes avec un promoteur actif CamV35S, car ce promoteur est utilisé pour la sélection de l’hygromycine.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’efficacité de la transformation est associée à plusieurs paramètres différents. Le choix des souches d’A. tumefaciens utilisées pour l’AMT est crucial. L’AGL-1 est l’une des souches les plus invasives découvertes et, pour cette raison, a été couramment utilisée dans l’AMT des plantes. La supplémentation du milieu d’induction avec du glucose (15-20 mM) est également importante pour l’efficacité de l’AMT. Étant donné que C. vulgaris peut se développer dans des condition…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient le professeur Paul Hooykaas d’avoir aimablement fourni le vecteur pCAMBIA1302 et Agrobacterium tumefaciens AGL1 de l’Institut de biologie de Leiden, Université de Leiden, Pays-Bas. Les auteurs tiennent également à remercier Eva Colic pour son aide dans la culture des transformants fluorescents. Ces travaux ont été financés par le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada et le programme Mitacs Accélération.
Materials
| 1 Kb Plus DNA ladder | FroggaBio | DM015 | |
| Acetosyringone | Fisher Scientific | D26665G | |
| Agrobacterium tumefaciens | Gold Biotechnologies | Strain: AGL-1; Gift from Prof. Paul Hooykaas | Genotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA |
| Biotin | Enzo Life Sciences | 89151-400 | |
| CaCl2·2H2O | VWR | BDH9224-1KG | |
| Cefotaxime | AK Scientific | J90010 | |
| Chlorella vulgaris | University of Texas at Austin Culture Collection of Algae | Strain: UTEX 395 | Wildtype strain |
| CoCl2·6H2O | Sigma Aldrich | C8661-25G | |
| CuSO4·5H2O | EMD Millipore | CX2185-1 | |
| FeCl3·6H2O | VWR | BDH9234-500G | |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 1652662 | Main unit equipped with PC module. |
| GeneJET Plant Genome Purification Kit | Thermo Scientific | K0791 | |
| Glacial acetic acid | VWR | CABDH3093-2.2P | |
| Glycerol | BioBasic | GB0232 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H-3375 | |
| Hygromycin B | Fisher Scientific | AAJ6068103 | |
| K2HPO4 | VWR | BDH9266-500G | |
| Kanamycin | Gold Biotechnologies | K-250-25 | |
| KH2PO4 | VWR | BDH9268-500G | |
| MgSO4·7H2O | VWR | 97062-134 | |
| MnCl2·4H2O | JT Baker | BAKR2540-01 | |
| Na2CO3 | VWR | BDH7971-1 | |
| Na2EDTA·2H2O | JT Baker | 8993-01 | |
| Na2MoO4·2H2O | JT Baker | BAKR3764-01 | |
| NaCl | VWR | BDH7257-7 | |
| NaH2PO4 H2O | Millipore Sigma | CA80058-650 | |
| NaNO3 | VWR | BDH4574-500G | |
| NEBExpress Ni Resin | NewEngland BioLabs | NEB #S1427 | |
| NH4Cl | VWR | BDH9208-500G | |
| pCAMBIA1302 | Leiden University | Gift from Prof. Paul Hooykaas | pBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator) |
| Polypropylene Columns (5 mL) | QIAGEN | 34964 | |
| Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mL | Bio-Rad | 1610363 | |
| Rifampicin | Millipore Sigma | R3501-1G | |
| SunBlaster LED Strip Light 48 Inch | SunBlaster | 210000000906 | |
| Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer | BioTEK | S4MLFPTA | |
| Tetracycline | Thermo Scientific Chemicals | CAAAJ61714-14 | |
| TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | 1610185 | |
| Thiamine | TCI America | T0181-100G | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Tryptone | BioBasic | TG217(G211) | |
| Vitamin B12 (cyanocobalamin) | Enzo Life Sciences | 89151-436 | |
| Yeast Extract | BioBasic | G0961 | |
| ZnSO4·7H2O | JT Baker | 4382-01 |
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