Summary

脊髄刺激時の運動ニューロンにおける全細胞パッチクランプ記録のための脊髄スライスの ex vivo 調製

Published: September 08, 2023
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Summary

このプロトコルは研究者が脊髄を分け、細胞生存率を同時に維持することの彼らの技術を改善するのを助けることができる高い時空間決断の脊髄の刺激(SCS)への運動ニューロンの電気応答を調査するのにパッチ・クランプを使用して方法を記述する。

Abstract

脊髄刺激(SCS)は、脊髄損傷(SCI)後の自発運動機能を効果的に回復させることができます。運動ニューロンは感覚運動行動を実行する最後のユニットであるため、SCSによる運動ニューロンの電気的応答を直接研究することは、脊髄運動調節の根底にあるロジックを理解するのに役立ちます。多様な刺激特性と細胞応答を同時に記録するには、パッチクランプが単一細胞スケールで電気生理学的特性を研究するのに適した方法です。しかし、この目標を達成するには、細胞の生存率を維持すること、脊髄を骨構造から迅速に分離すること、SCSを使用して活動電位をうまく誘導することなど、まだいくつかの複雑な困難があります。本稿では、運動ニューロンのSCSに対する電気的応答を高い時空間分解能で研究し、脊髄の分離と細胞生存率の維持を同時に行う技術を向上させ、運動ニューロン上のSCSの電気的メカニズムを円滑に研究し、無駄な試行錯誤を避けるための詳細なプロトコールを提示する。

Introduction

脊髄刺激(SCS)は、脊髄損傷(SCI)後の自発運動機能を効果的に回復させることができます。Andreas Rowaldらは、SCSが下肢の自発運動と体幹機能を1日で可能にすることを報告しました1。自発運動回復のためのSCSの生物学的メカニズムを探ることは、より正確なSCS戦略を開発するための重要かつトレンドの研究分野です。例えば、Grégoire Courtineのチームは、脊髄の興奮性Vsx2介在ニューロンとHoxa10ニューロンがSCSに応答する重要なニューロンであり、細胞特異的なニューロモデュレーションがSCI2後のラットの歩行能力を回復するために実行可能であることを実証しました。しかし、単一細胞スケールでのSCSの電気的メカニズムに焦点を当てた研究はほとんどありません。古典的なイカ実験3,4,5では、閾値超の直流刺激が活動電位(AP)を誘発できることはよく知られていますが、SCSなどのパルス交流電気刺激が運動信号の生成にどのように影響するかはまだ不明です。

脊髄内神経回路の複雑さを考えると、SCSの電気的メカニズムを調べるためには、細胞集団の適切な選択が重要です。SCSは固有受容経路6を活性化することによって運動機能を回復させるが、運動ニューロンは、固有受容感覚情報の求心性入力7の統合から導かれる運動指令を実行する最後の単位である。したがって、SCSで運動ニューロンの電気的特性を直接研究することは、脊髄運動調節の根底にある論理を理解するのに役立ちます。

周知のように、パッチクランプは、極めて高い時空間分解能を有する細胞電気生理学的記録のゴールデンスタンダードな方法である8。そこで、本研究では、SCSに対する運動ニューロンの電気的応答を研究するためにパッチクランプを用いて方法を検討する。脳パッチクランプ9と比較して、脊髄パッチクランプは、以下の理由により、より困難である:(1)脊髄は、より優れた細胞生存率を得るために、非常に細かいマイクロマニピュレーションと厳密な氷冷メンテナンスを必要とする、小さな体積の脊柱管によって保護されている。(2)脊髄は細すぎて切断トレイに固定できないため、低融点アガロースに浸漬し、固化後にトリミングする必要があります。

したがって、この方法は、脊髄を解剖し、同時に細胞の生存率を維持するための技術的な詳細を提供し、運動ニューロン上のSCSの電気的メカニズムをスムーズに研究し、不必要な試行錯誤を回避します。

Protocol

施設動物実験委員会は、すべての動物実験を承認し、研究は関連する動物福祉規則に従って実施されました。 1.動物の調製 動物住居情報:特定の病原体のない環境での雄のSprague-Dawleyラット(出生後10〜14日、P10〜P14)を飼育します。注:室内条件は20°C±2°C、湿度:50%〜60%、12時間の明暗サイクルで維持されました。動物は食べ物と水を自由に入手?…

Representative Results

微細な操作中の厳格な低温維持(補足図1、補足図2、および図1)のおかげで、細胞生存率はその後の電気生理学的記録を実行するのに十分良好でした。臨床シナリオを可能な限りシミュレートするために、マイクロマニピュレーションを使用して、SCS陰極と陽極をそれぞれ背側正中線とDREZの近くに配置し(図2)、後角の神経信号を開始し?…

Discussion

SCSによって変調された運動情報は、最終的に運動ニューロンに収束されます。したがって、運動ニューロンを研究対象とすることで、研究デザインが簡素化され、SCSの神経調節メカニズムがより直接的に明らかになる可能性があります。多様な刺激特性と細胞応答を同時に記録するには、パッチクランプが単一細胞スケールで電気生理学的特性を研究するのに適した方法です。しかし、細胞?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、中国国家自然科学基金会の若手研究者(52207254および82301657)および中国ポスドク科学基金(2022M711833)から資金提供を受けました。

Materials

Adenosine 5’-triphosphate magnesium salt Sigma A9187
Ascorbic Acid Sigma A4034
CaCl2·2H2O Sigma C5080
Choline Chloride Sigma C7527
Cover slide tweezers VETUS 36A-SA Clip a slice
D-Glucose Sigma G8270
EGTA Sigma E4378
Fine scissors RWD Life Science S12006-10 Cut the diaphragm
Fluorescence Light Source Olympus  U-HGLGPS
Fluoro-Gold Fluorochrome Fluorochrome Label the motor neuron
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate Sigma G8877
HEPES Sigma H3375
infrared CCD camera Dage-MTI IR-1000E
KCl Sigma P5405
K-gluconate Sigma P1847
Low melting point agarose Sigma A9414
MgSO4·7H2O Sigma M2773
Micromanipulator  Sutter Instrument  MP-200
Micropipette puller Sutter instrument P1000
Micro-scissors  Jinzhong wa1020 Laminectomy
Microscope for anatomy Olympus  SZX10
Microscope for ecletrophysiology Olympus  BX51WI
Micro-toothed tweezers RWD Life Science F11008-09 Lift the cut vertebral body
NaCl Sigma S5886
NaH2PO4 Sigma S8282
NaHCO3 Sigma V900182
Na-Phosphocreatine Sigma P7936
Objective lens for ecletrophysiology Olympus  LUMPLFLN60XW working distance 2 mm 
Osmometer  Advanced  FISKE 210
Patch-clamp amplifier  Axon  Multiclamp 700B
Patch-clamp digitizer Axon  Digidata 1550B
pH meter  Mettler Toledo  FE28
Slice Anchor Multichannel system SHD-27H
Spinal cord stimulatior PINS T901
Toothed tweezer RWD Life Science F13030-10 Lift the xiphoid
Vibratome Leica VT1200S
Wide band ultraviolet excitation filter Olympus  U-MF2

References

  1. Rowald, A., et al. Activity-dependent spinal cord neuromodulation rapidly restores trunk and leg motor functions after complete paralysis. Nature Medicine. 28 (2), 260-271 (2022).
  2. Kathe, C., et al. The neurons that restore walking after paralysis. Nature. 611 (7936), 540-547 (2022).
  3. Smith, S. J., Buchanan, J., Osses, L. R., Charlton, M. P., Augustine, G. J. The spatial distribution of calcium signals in squid presynaptic terminals. The Journal of Physiology. 472, 573-593 (1993).
  4. Augustine, G. J. Regulation of transmitter release at the squid giant synapse by presynaptic delayed rectifier potassium current. The Journal of Physiology. 431, 343-364 (1990).
  5. Llinás, R., McGuinness, T. L., Leonard, C. S., Sugimori, M., Greengard, P. Intraterminal injection of synapsin I or calcium/calmodulin-dependent protein kinase II alters neurotransmitter release at the squid giant synapse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 3035-3039 (1985).
  6. Formento, E., et al. Electrical spinal cord stimulation must preserve proprioception to enable locomotion in humans with spinal cord injury. Nature Neuroscience. 21 (12), 1728-1741 (2018).
  7. Hari, K., et al. GABA facilitates spike propagation through branch points of sensory axons in the spinal cord. Nature Neuroscience. 25 (10), 1288-1299 (2022).
  8. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review Of Physiology. 46, 455-472 (1984).
  9. Leroy, F., Lamotte d’Incamps, B. The preparation of oblique spinal cord slices for ventral root stimulation. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (116), e54525 (2016).
  10. Sharples, S. A., Miles, G. B. Maturation of persistent and hyperpolarization-activated inward currents shapes the differential activation of motoneuron subtypes during postnatal development. Elife. 10, e71385 (2021).
  11. Bhumbra, G. S., Beato, M. Recurrent excitation between motoneurones propagates across segments and is purely glutamatergic. PLoS Biology. 16 (3), e2003586 (2018).
  12. Leroy, F., Lamotte d’Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Elife. 3, 04046 (2014).
  13. Tahir, R. A., Pabaney, A. H. Therapeutic hypothermia and ischemic stroke: A literature review. Surgical Neurology International. 7, S381-S386 (2016).
  14. Lu, Y., et al. Management of intractable pain in patients with implanted spinal cord stimulation devices during the COVID-19 pandemic using a remote and wireless programming system. Frontiers in Neuroscience. 14, 594696 (2020).
  15. Yao, Q., et al. Wireless epidural electrical stimulation in combination with serotonin agonists improves intraspinal metabolism in spinal cord injury rats. Neuromodulation. 24 (3), 416-426 (2021).
  16. Arlotti, M., Rahman, A., Minhas, P., Bikson, M. Axon terminal polarization induced by weak uniform dc electric fields: a modeling study. 2012 Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 4575-4578 (2012).
  17. Espino, C. M., et al. Na(V)1.1 is essential for proprioceptive signaling and motor behaviors. Elife. 11, e79917 (2022).
  18. Romer, S. H., Deardorff, A. S., Fyffe, R. E. W. A molecular rheostat: Kv2.1 currents maintain or suppress repetitive firing in motoneurons. The Journal of Physiology. 597 (14), 3769-3786 (2019).
  19. Yao, X., et al. Structures of the R-type human Ca(v)2.3 channel reveal conformational crosstalk of the intracellular segments. Nature Communications. 13 (1), 7358 (2022).
  20. Bandres, M. F., Gomes, J., McPherson, J. G. Spontaneous multimodal neural transmission suggests that adult spinal networks maintain an intrinsic state of readiness to execute sensorimotor behaviors. Journal Of Neuroscience. 41 (38), 7978-7990 (2021).
  21. Manuel, M., Heckman, C. J. Simultaneous intracellular recording of a lumbar motoneuron and the force produced by its motor unit in the adult mouse in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e4312 (2012).
  22. Luo, X., Wang, S., Rutkove, S. B., Sanchez, B. Nonhomogeneous volume conduction effects affecting needle electromyography: an analytical and simulation study. Physiological Measurement. 42 (11), (2021).
  23. Barra, B., et al. Epidural electrical stimulation of the cervical dorsal roots restores voluntary upper limb control in paralyzed monkeys. Nature Neuroscience. 25 (7), 924-934 (2022).
  24. Powell, M. P., et al. Epidural stimulation of the cervical spinal cord for post-stroke upper-limb paresis. Nature Medicine. 29 (3), 689-699 (2023).
  25. Wenger, N., et al. Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury. Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).
  26. Özyurt, M. G., Ojeda-Alonso, J., Beato, M., Nascimento, F. In vitro longitudinal lumbar spinal cord preparations to study sensory and recurrent motor microcircuits of juvenile mice. Journal of Neurophysiology. 128 (3), 711-726 (2022).
  27. Moraud, E. M., et al. Mechanisms underlying the neuromodulation of spinal circuits for correcting gait and balance deficits after spinal cord injury. Neuron. 89 (4), 814-828 (2016).
  28. Capogrosso, M., et al. A computational model for epidural electrical stimulation of spinal sensorimotor circuits. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19326-19340 (2013).

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Cite This Article
Yao, Q., Luo, X., Liu, J., Li, L. The Ex vivo Preparation of Spinal Cord Slice for the Whole-Cell Patch-Clamp Recording in Motor Neurons During Spinal Cord Stimulation. J. Vis. Exp. (199), e65385, doi:10.3791/65385 (2023).

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