Summary

척수 자극 중 운동 뉴런의 전체 세포 패치-클램프 기록을 위한 척수 절편의 생체 외 제조

Published: September 08, 2023
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Summary

이 프로토콜은 패치 클램프를 사용하여 높은 시공간 분해능으로 척수 자극(SCS)에 대한 운동 뉴런의 전기적 반응을 연구하는 방법을 설명하며, 이를 통해 연구자들은 척수를 분리하고 세포 생존력을 동시에 유지하는 기술을 향상시킬 수 있습니다.

Abstract

척수 자극술(SCS)은 척수 손상(SCI) 후 운동 기능을 효과적으로 회복할 수 있습니다. 운동 뉴런은 감각 운동 행동을 실행하는 최종 단위이기 때문에 SCS로 운동 뉴런의 전기 반응을 직접 연구하면 척추 운동 조절의 기본 논리를 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 다양한 자극 특성과 세포 반응을 동시에 기록하기 위해 패치 클램프는 단일 세포 규모에서 전기생리학적 특성을 연구하는 좋은 방법입니다. 그러나 이 목표를 달성하는 데에는 세포 생존력 유지, 뼈 구조에서 척수를 빠르게 분리, SCS를 사용하여 활동 전위를 성공적으로 유도하는 등 몇 가지 복잡한 어려움이 여전히 있습니다. 여기에서는 패치 클램프를 사용하여 높은 시공간 해상도로 SCS에 대한 운동 뉴런의 전기적 반응을 연구하는 상세한 프로토콜을 제시하며, 이를 통해 연구자가 척수 분리 및 세포 생존력 유지 기술을 향상시켜 운동 뉴런에 대한 SCS의 전기적 메커니즘을 원활하게 연구하고 불필요한 시행착오를 피할 수 있습니다.

Introduction

척수 자극술(SCS)은 척수 손상(SCI) 후 운동 기능을 효과적으로 회복할 수 있습니다. 안드레아스 로왈드(Andreas Rowald) 등은 SCS가 단 하루 만에 하지 운동과 몸통 기능을 가능하게 한다고 보고했다1. 운동 회복을 위한 SCS의 생물학적 메커니즘을 탐구하는 것은 보다 정확한 SCS 전략을 개발하기 위한 중요하고 추세적인 연구 분야입니다. 예를 들어, 그레구아르 쿠르틴(Grégoire Courtine)의 연구팀은 척수의 흥분성 Vsx2 인터뉴런과 Hoxa10 뉴런이 SCS에 반응하는 핵심 뉴런이며, SCI2 이후 쥐의 보행 능력을 회복하기 위해 세포 특이적 신경조절이 가능하다는 것을 입증했습니다. 그러나 단일 셀 규모에서 SCS의 전기적 메커니즘에 초점을 맞춘 연구는 거의 없습니다. 고전적인 오징어 실험 3,4,5에서 초임계 직류 자극이 활동 전위(AP)를 유도할 수 있다는 것은 잘 알려져 있지만, SCS와 같은 펄스 교류 전기 자극이 모터 신호 생성에 어떤 영향을 미치는지는 여전히 불분명합니다.

척추 내 신경 회로의 복잡성을 감안할 때, 세포 집단에 대한 적절한 선택은 SCS의 전기적 메커니즘을 조사하는 데 중요합니다. SCS는 고유수용성 경로(proprioceptive pathway)6를 활성화시킴으로써 운동기능을 회복시키지만, 운동뉴런(motor neuron)은 고유수용감각 정보 구심성 입력(affrioception information afferent input)7의 통합으로부터 유도된 운동 명령을 실행하는 최종 단위이다. 따라서 SCS를 사용하여 운동 뉴런의 전기적 특성을 직접 연구하면 척추 운동 조절의 기본 논리를 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.

아시다시피, 패치 클램프는 매우 높은 시공간 분해능(spatiotemporal resolution)8을 가진 세포 전기생리학적 기록을 위한 황금 표준 방법입니다. 따라서 본 연구에서는 SCS에 대한 운동 뉴런의 전기적 반응을 연구하기 위해 패치 클램프를 사용하는 방법을 설명합니다. 뇌 패치-클램프(9)와 비교했을 때, 척수 패치-클램프는 다음과 같은 이유로 더 어렵다: (1) 척수는 아주 작은 부피의 척추관에 의해 보호되며, 이는 더 나은 세포 생존력을 얻기 위해 매우 미세한 미세 조작과 엄격한 얼음처럼 차가운 유지가 필요하다. (2) 척수가 너무 가늘어서 절단 트레이에 고정할 수 없기 때문에 저융점 아가로스에 담그고 응고 후 다듬어야 합니다.

따라서 이 방법은 척수를 해부하고 동시에 세포 생존력을 유지하는 데 있어 운동 뉴런에 대한 SCS의 전기적 메커니즘을 원활하게 연구하고 불필요한 시행착오를 피할 수 있는 기술적 세부 사항을 제공합니다.

Protocol

기관 동물 관리 및 사용 위원회는 모든 동물 실험을 승인했으며 연구는 관련 동물 복지 규정에 따라 수행되었습니다. 1. 동물 준비 마리주거 정보: 수컷 Sprague-Dawley 쥐(출생 후 10-14일, P10-P14)를 특정 병원체가 없는 환경에서 사육합니다.알림: 실내 조건은 20°C ± 2°C, 습도: 50%-60%, 12시간 밝음/어두움 주기로 유지되었습니다. 동물들은 음식과 물을 자?…

Representative Results

미세 작동 중 엄격한 저온 유지 덕분에(보충 그림 1, 보충 그림 2 및 그림 1) 세포 생존율은 후속 전기생리학적 기록을 수행하기에 충분했습니다. 임상 시나리오를 최대한 시뮬레이션하기 위해 미세 조작을 사용하여 SCS 음극과 양극을 각각 등쪽 정중선과 DREZ 근처에 배치했으며(그림 2), 등쪽 뿔에서 신경 신호를 시작하여 운동 기둥의 배외측…

Discussion

SCS에 의해 조절된 운동 정보는 최종적으로 운동 뉴런으로 수렴됩니다. 따라서 운동 뉴런을 연구 목표로 삼으면 연구 설계를 단순화하고 SCS의 신경 조절 메커니즘을 보다 직접적으로 밝힐 수 있습니다. 다양한 자극 특성과 세포 반응을 동시에 기록하기 위해 패치 클램프는 단일 세포 규모에서 전기생리학적 특성을 연구하는 좋은 방법입니다. 그러나 세포 생존력을 유지하는 방법, 뼈 구조에서 척?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 젊은 학자(52207254 및 82301657)와 중국 박사후 과학 기금(2022M711833)의 지원을 받았습니다.

Materials

Adenosine 5’-triphosphate magnesium salt Sigma A9187
Ascorbic Acid Sigma A4034
CaCl2·2H2O Sigma C5080
Choline Chloride Sigma C7527
Cover slide tweezers VETUS 36A-SA Clip a slice
D-Glucose Sigma G8270
EGTA Sigma E4378
Fine scissors RWD Life Science S12006-10 Cut the diaphragm
Fluorescence Light Source Olympus  U-HGLGPS
Fluoro-Gold Fluorochrome Fluorochrome Label the motor neuron
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate Sigma G8877
HEPES Sigma H3375
infrared CCD camera Dage-MTI IR-1000E
KCl Sigma P5405
K-gluconate Sigma P1847
Low melting point agarose Sigma A9414
MgSO4·7H2O Sigma M2773
Micromanipulator  Sutter Instrument  MP-200
Micropipette puller Sutter instrument P1000
Micro-scissors  Jinzhong wa1020 Laminectomy
Microscope for anatomy Olympus  SZX10
Microscope for ecletrophysiology Olympus  BX51WI
Micro-toothed tweezers RWD Life Science F11008-09 Lift the cut vertebral body
NaCl Sigma S5886
NaH2PO4 Sigma S8282
NaHCO3 Sigma V900182
Na-Phosphocreatine Sigma P7936
Objective lens for ecletrophysiology Olympus  LUMPLFLN60XW working distance 2 mm 
Osmometer  Advanced  FISKE 210
Patch-clamp amplifier  Axon  Multiclamp 700B
Patch-clamp digitizer Axon  Digidata 1550B
pH meter  Mettler Toledo  FE28
Slice Anchor Multichannel system SHD-27H
Spinal cord stimulatior PINS T901
Toothed tweezer RWD Life Science F13030-10 Lift the xiphoid
Vibratome Leica VT1200S
Wide band ultraviolet excitation filter Olympus  U-MF2

References

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Cite This Article
Yao, Q., Luo, X., Liu, J., Li, L. The Ex vivo Preparation of Spinal Cord Slice for the Whole-Cell Patch-Clamp Recording in Motor Neurons During Spinal Cord Stimulation. J. Vis. Exp. (199), e65385, doi:10.3791/65385 (2023).

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