アシネトバクターバイオフィルムの定量化、生存率評価、可視化戦略
Summary
このプロトコルは Acinetobacterのbiofilmsのinoculum、水紫色の染料、biofilmsの生存可能な計算および視覚化を使用してmicrotitterの版のbiofilmの定量化の準備を記述する。
Abstract
アシネトバクター は院内感染を引き起こし、そのバイオフィルム形成は病院環境などの乾燥した表面での生存に寄与する可能性があります。したがって、バイオフィルムの定量化と可視化は、 アシネトバクター 株が院内感染を引き起こす可能性を評価するための重要な方法です。マイクロプレートの表面に形成されるバイオフィルムは、体積と細胞数で定量化できます。バイオフィルムの量は、クリスタルバイオレットを使用した染色、洗浄、エタノールによる脱色、およびマイクロプレートリーダーを使用した可溶化色素の測定によって定量化できます。バイオフィルムに埋め込まれた細胞の数を定量化するために、バイオフィルムを細胞スクレーパーを使用してスクラップし、生理食塩水で回収し、ガラスビーズの存在下で激しく攪拌し、アシネトバクター寒天培地に広げます。次に、プレートを30°Cで24〜42時間インキュベートします。インキュベーション後、赤いコロニーを列挙して、バイオフィルム内の細胞数を推定します。この実行可能な計数法は、混合種バイオフィルム中の アシネトバクター 細胞を計数するのにも有用です。 アシネトバクター のバイオフィルムは、蛍光色素を用いて可視化することができます。顕微鏡分析用に設計された市販のマイクロプレートを使用して、バイオフィルムを形成します。次に、底面に付着したバイオフィルムをSYTO9およびヨウ化プロピジウム色素で染色し、洗浄した後、共焦点レーザー走査型顕微鏡で可視化します。
Introduction
アシネトバクターは院内感染を引き起こすことが知られており、特に医療施設でのヒト感染の報告が増えています1。病院、医療施設、食品関連環境で広く普及しています2,3,4。ベッドの手すり、ベッドサイドテーブル、人工呼吸器の表面、シンク4などの病院の表面を含む環境で長期間生存できます。このような環境表面への残留性は、アシネトバクター4の院内感染に寄与する重要な要因の1つである可能性があります。
バイオフィルムは微生物の生命形態であり、生きた微生物細胞と細胞由来の細胞外高分子物質(EPS)で構成される微生物マトリックスである5。微生物細胞はマトリックスに埋め込まれており、多くの場合、熱、塩分、乾燥、抗生物質、消毒剤、せん断力などの環境ストレスに対して高い耐性があります6,7。
アシネトバクターは表面にバイオフィルムを形成する可能性があり、病院の表面を含む環境表面での生存期間の延長や、抗生物質治療に対する耐性の強化に寄与する可能性があることを示唆しています8,9。さらに、アシネトバクターのバイオフィルム形成は、ヒトの臨床転帰と大きく関連している可能性があります8。したがって、アシネトバクター株のバイオフィルム形成性は、環境生存とヒト感染を予測する際の指標の1つである可能性があります8,10。
表面に付着したバイオフィルムを定量化して可視化し、バイオフィルムの形成性を評価することができます。表面付着したバイオフィルムを定量するために、バイオフィルムは通常、クリスタルバイオレットなどのバイオフィルム染色色素で染色され、色素は溶液中で溶出し、光学濃度について測定されます11。バイオフィルムの可視化は、バイオフィルムの形成性を評価するためのもう一つの良いアプローチである11。蛍光色素を用いた特異性を用いた共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)可視化法は、SEM12,13などの他の技術と比較して、バイオフィルムの形態を特徴付けるのに有用である可能性があります。
バイオフィルム中の生細胞をカウントして、バイオフィルム中の生細胞の数を推定することができる11。バイオフィルムに埋め込まれた生細胞を剥離し、希釈し、寒天プレート上に広げ、インキュベートし、列挙します。細胞数が多いほど感染線量を満たす可能性が高いため、細胞数に関連する感染電位など、バイオフィルムに関するより詳細な情報を提供することができる13,14。
本稿では、(1)表面付着バイオフィルムの定量化、(2)バイオフィルム中の生細胞のカウント、(3) アシネトバクターのCLSMを用いたバイオフィルムの可視化のプロトコールを段階的に紹介します。提示されたプロトコルは、 アシネトバクター 分離株のバイオフィルム形成性を評価し、それらのバイオフィルムを特徴付ける方法を説明しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
記載されたプロトコルを使用して、さまざまな程度の アシネトバクター 分離株のバイオフィルム形成を測定、視覚化し、バイオフィルム内の生細胞を推定しました(図1、図 2、 および図3)。
このプロトコルでは、アシネトバクターの増殖に30°C、バイオフィルム形成に25°Cの2つの異なる温度…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、韓国食品技術研究院(KFRI)の科学技術情報通信部(E0210702-03)主研究プログラムの支援を受けて行われました。
Materials
| 96-well cell culture plate | SPL | 30096 | Polystyrene 96-well plate |
| BHI (Brain Heart Infusion) broth | Merck KGaA | 1.10493.0500 | |
| Blood Agar Base Plate | KisanBio | MB-B1005-P50 | Growth media for Acinetobacter |
| CHROMagar Acinetobacter | CHROMagar | AC092 | Selective plate for Acinetobacter |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | V5265 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit | Invitrogen | L10316 | SYTO9 and propidium iodide |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO NanoQuant | Biofilm measurement |
| RBC Glass Plating Beads | RBC | RG001 | Glass beads |
| μ-Plate 96 Well Black | ibidi | 89621 | Microplate intended for CLSM |
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