Acinetobacter Biofilms에 대한 정량화, 생존력 평가 및 시각화 전략
Summary
이 프로토콜은 접종물의 준비, 크리스탈 바이올렛 염료를 사용한 마이크로타이터 플레이트의 생물막 정량화, 생물막의 생존 가능한 수 및 아시네토박터의 생물막 시각화에 대해 설명합니다.
Abstract
아시네토박터는 병원 내 감염을 일으키며 생물막 형성은 병원 환경과 같은 건조한 표면에서 생존에 기여할 수 있습니다. 따라서 생물막 정량화 및 시각화는 아시네토박터 균주가 병원 내 감염을 일으킬 가능성을 평가하는 중요한 방법입니다. 마이크로플레이트 표면에 형성되는 생물막은 부피와 세포 수 측면에서 정량화할 수 있습니다. 생물막 부피는 크리스탈 바이올을 사용하여 염색하고, 세척하고, 에탄올을 사용하여 탈염한 다음, 마이크로플레이트 리더를 사용하여 가용화된 염료를 측정하여 정량화할 수 있습니다. 생물막에 묻힌 세포의 수를 정량화하기 위해 세포 스크레이퍼를 사용하여 생물막을 긁어내고, 식염수에서 수확하고, 유리 구슬의 존재 하에서 격렬하게 교반하고, 아시네토박터 한천에 퍼뜨립니다. 그런 다음 플레이트를 30°C에서 24-42시간 동안 배양합니다. 배양 후에, 빨간 식민지는 biofilms에 있는 세포의 수를 추정하기 위하여 열거됩니다. 이 실행 가능한 계수 방법은 혼합 종 생물막에서 아시네토박터 세포를 계수하는 데에도 유용할 수 있습니다. 아시네토박터 생물막은 형광 염료를 사용하여 시각화할 수 있습니다. 현미경 분석을 위해 설계된 상업적으로 이용 가능한 마이크로플레이트는 생물막을 형성하는 데 사용됩니다. 그런 다음 바닥 표면에 부착된 생물막을 SYTO9 및 프로피듐 요오드화물 염료로 염색하고 세척한 다음 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경으로 시각화합니다.
Introduction
아시네토박터는 병원 내 감염을 일으키는 것으로 알려져 있으며, 특히 의료 시설에서 인체 감염이 점점 더 많이 보고되고 있습니다1. 병원, 의료 시설 및 식품 관련 환경에 널리 퍼져 있습니다 2,3,4. 침대 레일, 침대 옆 탁자, 인공 호흡기 표면 및 싱크대와 같은 병원 표면을 포함한 환경에서 장기간 생존할 수 있습니다4. 환경 표면에서의 이러한 지속성은 아시네토박터4의 병원 감염에 기여하는 중요한 요인 중 하나일 수 있습니다.
생물막은 미생물 생명체의 한 형태이며 살아있는 미생물 세포와 세포의 세포외 고분자 물질(EPS)로 구성된 미생물 매트릭스입니다5. 미생물 세포는 매트릭스에 내장되어 있으며 종종 열, 염분, 건조, 항생제, 소독제 및 전단력과 같은 환경 스트레스에 매우 강합니다 6,7.
아시네토박터는 표면에 생물막을 형성할 수 있으며, 이는 병원 표면을 포함한 환경 표면에서 생존 연장에 기여하고 항생제 치료에 대한 내성을 향상시키는 데 기여할 수 있음을 시사합니다 8,9. 또한 아시네토박터의 생물막 형성은 인간의 임상 결과와 밀접한 관련이 있을 수 있다8. 따라서 아시네토박터 균주의 생물막 형성성은 환경 생존 및 인간 감염을 예측하는 지표 중 하나가 될 수 있다 8,10.
표면 부착 생물막은 정량화하고 시각화하여 생물막 형성성을 평가할 수 있습니다. 표면 부착 생물막을 정량화하기 위해, 생물막은 일반적으로 크리스탈 바이올렛과 같은 생물막 염색 염료에 의해 염색되고, 염료는 용액에서 용출되고 광학 밀도11에 대해 측정된다. 생물막의 시각화는 생물막 형성성을 평가하는 또 다른 좋은 접근법이다11. 형광 염료를 사용하여 특이성을 사용하는 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM) 시각화 방법은 SEM12,13과 같은 다른 기술에 비해 생물막 형태를 특성화하는 데 더 유용할 수 있습니다.
생물막에서 생존 가능한 세포는 생물막에서 생존 가능한 세포의 수를 추정하기 위해 계수될 수있다 11. biofilms에서 끼워넣어진 생존 가능한 세포는 분리되고, 묽게 되고, 한천 격판덮개에 퍼지고, 배양되고, 열거됩니다. 세포의 수가 많을수록 전염성 투여량을 충족시킬 가능성이 높기 때문에 세포 수13,14와 관련된 감염 가능성과 같은 생물막에 대한 자세한 정보를 제공할 수 있습니다.
이 기사에서는 (1) 표면 부착 생물막을 정량화하고, (2) 생물막에서 생존 가능한 세포를 계산하고, (3) 아시네토박터의 CLSM을 사용하여 생물막을 시각화하는 단계별 프로토콜을 제시합니다. 제시된 프로토콜은 아시네토박터 분리물의 생물막 형성성을 평가하고 이들의 생물막을 특성화하는 방법을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
기술된 프로토콜을 사용하여, 다양한 정도의 아시네토박터 분리물의 생물막 형성을 측정하고, 시각화하고, 생물막에서 생존 가능한 세포를 추정하였다(도 1, 도 2 및 도 3).
이 프로토콜에서는 성장을 위한 30°C와 아시네토박터의 생물막 형성을 위한 25°C의 두 가지 다른 온도를 사용했습니다. 많?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
본 연구는 과학기술정보통신부의 지원을 받아 한국식품연구원(KFRI)의 본과제(E0210702-03)의 지원을 받았다.
Materials
| 96-well cell culture plate | SPL | 30096 | Polystyrene 96-well plate |
| BHI (Brain Heart Infusion) broth | Merck KGaA | 1.10493.0500 | |
| Blood Agar Base Plate | KisanBio | MB-B1005-P50 | Growth media for Acinetobacter |
| CHROMagar Acinetobacter | CHROMagar | AC092 | Selective plate for Acinetobacter |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | V5265 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit | Invitrogen | L10316 | SYTO9 and propidium iodide |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO NanoQuant | Biofilm measurement |
| RBC Glass Plating Beads | RBC | RG001 | Glass beads |
| μ-Plate 96 Well Black | ibidi | 89621 | Microplate intended for CLSM |
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