Stratégies de quantification, d’évaluation de la viabilité et de visualisation des biofilms d’Acinetobacter
Summary
Ce protocole décrit la préparation de l’inoculum, la quantification du biofilm sur des plaques de microtitration à l’aide d’un colorant violet cristallin, le nombre viable dans les biofilms et la visualisation des biofilms d’Acinetobacter.
Abstract
Acinetobacter provoque des infections nosocomiales et la formation de son biofilm peut contribuer à la survie sur des surfaces sèches telles que les environnements hospitaliers. Ainsi, la quantification et la visualisation du biofilm sont des méthodes importantes pour évaluer le potentiel des souches d’Acinetobacter à provoquer des infections nosocomiales. Les biofilms qui se forment à la surface de la microplaque peuvent être quantifiés en termes de volume et de nombre de cellules. Les volumes de biofilm peuvent être quantifiés par coloration à l’aide de violet cristallin, lavage, décoloration à l’éthanol, puis mesure du colorant solubilisé à l’aide d’un lecteur de microplaques. Pour quantifier le nombre de cellules incorporées dans les biofilms, les biofilms sont éliminés à l’aide de racleurs cellulaires, récoltés dans la solution saline, vigoureusement agités en présence de billes de verre et étalés sur gélose Acinetobacter. Ensuite, les plaques sont incubées à 30 °C pendant 24 à 42 h. Après incubation, les colonies rouges sont dénombrées pour estimer le nombre de cellules dans les biofilms. Cette méthode de comptage viable peut également être utile pour compter les cellules Acinetobacter dans les biofilms d’espèces mixtes. Les biofilms d’Acinetobacter peuvent être visualisés à l’aide de colorants fluorescents. Une microplaque disponible dans le commerce et conçue pour l’analyse microscopique est utilisée pour former des biofilms. Ensuite, les biofilms attachés à la surface inférieure sont colorés avec des colorants SYTO9 et à l’iodure de propidium, lavés, puis visualisés par microscopie confocale à balayage laser.
Introduction
Acinetobacter est connu pour provoquer des infections nosocomiales, et son infection humaine, en particulier dans les établissements de santé, est de plus en plus signalée1. Il est répandu dans les hôpitaux, les établissements de santé et les environnements associés à l’alimentation 2,3,4. Il peut survivre pendant une longue période dans des environnements tels que les surfaces hospitalières telles que les barrières de lit, les tables de chevet, la surface des ventilateurs et les éviers4. Une telle persistance sur les surfaces environnementales peut être l’un des facteurs importants contribuant aux infections nosocomiales d’Acinetobacter4.
Le biofilm est une forme de vie microbienne et est une matrice microbienne composée de cellules microbiennes vivantes et de substances polymères extracellulaires (EPS) provenant des cellules5. Les cellules microbiennes sont intégrées dans la matrice et sont souvent très résistantes aux stress environnementaux tels que la chaleur, les sels, la sécheresse, les antibiotiques, les désinfectants et les forces de cisaillement 6,7.
Acinetobacter peut former des biofilms sur les surfaces, ce qui suggère qu’il peut contribuer à une survie prolongée sur les surfaces environnementales, y compris les surfaces hospitalières, et à une résistance accrue aux traitements antibiotiques 8,9. De plus, la formation d’un biofilm d’Acinetobacter pourrait être fortement associée aux résultats cliniques chez l’homme8. Par conséquent, la formabilité du biofilm des souches d’Acinetobacter pourrait être l’un des indicateurs de prédiction de la survie environnementale et des infections humaines 8,10.
Les biofilms attachés à la surface peuvent être quantifiés et visualisés pour évaluer la formabilité du biofilm. Pour quantifier les biofilms attachés à la surface, les biofilms sont normalement colorés par des colorants de coloration du biofilm tels que le violet cristallin, et les colorants sont élués en solution et mesurés pour la densité optique11. La visualisation des biofilms est une autre bonne approche pour évaluer la formabilité des biofilms11. La méthode de visualisation de la microscopie confocale à balayage laser (CLSM) utilisant la spécificité à l’aide de colorants fluorescents pourrait être plus utile pour caractériser la morphologie du biofilm par rapport à d’autres techniques telles que MEB12,13.
Les cellules viables dans les biofilms peuvent être comptées pour estimer le nombre de cellules viables dans les biofilms11. Les cellules viables intégrées dans les biofilms sont détachées, diluées, étalées sur des plaques de gélose, incubées et dénombrées. Étant donné que le nombre plus élevé de cellules est susceptible de répondre à la dose infectieuse, il peut fournir des informations plus détaillées sur les biofilms, tels que les potentiels d’infection associés au nombre de cellules13,14.
Cet article présente des protocoles étape par étape pour (1) quantifier les biofilms attachés à la surface, (2) compter les cellules viables dans les biofilms et (3) visualiser les biofilms à l’aide du CLSM d’Acinetobacter. Les protocoles présentés décrivent les méthodes permettant d’évaluer la formabilité du biofilm des isolats d’Acinetobacter et de caractériser leurs biofilms.
Protocol
Representative Results
Discussion
À l’aide du protocole décrit, la formation de biofilms d’isolats d’Acinetobacter à des degrés divers a été mesurée, visualisée et les cellules viables dans les biofilms ont été estimées (Figure 1, Figure 2 et Figure 3).
Dans ce protocole, deux températures différentes ont été utilisées, 30 °C pour la croissance et 25 °C pour la formation du biofilm d’Acinetobacter</e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par le Programme principal de recherche (E0210702-03) de l’Institut coréen de recherche sur l’alimentation (KFRI), financé par le ministère des Sciences et des TIC.
Materials
| 96-well cell culture plate | SPL | 30096 | Polystyrene 96-well plate |
| BHI (Brain Heart Infusion) broth | Merck KGaA | 1.10493.0500 | |
| Blood Agar Base Plate | KisanBio | MB-B1005-P50 | Growth media for Acinetobacter |
| CHROMagar Acinetobacter | CHROMagar | AC092 | Selective plate for Acinetobacter |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | V5265 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit | Invitrogen | L10316 | SYTO9 and propidium iodide |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO NanoQuant | Biofilm measurement |
| RBC Glass Plating Beads | RBC | RG001 | Glass beads |
| μ-Plate 96 Well Black | ibidi | 89621 | Microplate intended for CLSM |
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