Стратегии количественной оценки, оценки жизнеспособности и визуализации биопленок Acinetobacter
Summary
Этот протокол описывает подготовку посевного материала, количественное определение биопленки на микротитровых планшетах с использованием кристаллического фиолетового красителя, количество жизнеспособных веществ в биопленках и визуализацию биопленок Acinetobacter.
Abstract
Acinetobacter вызывает внутрибольничные инфекции, и его образование биопленки может способствовать выживанию на сухих поверхностях, таких как больничные условия. Таким образом, количественная оценка и визуализация биопленки являются важными методами оценки способности штаммов Acinetobacter вызывать внутрибольничные инфекции. Биопленки, образующиеся на поверхности микропланшета, могут быть количественно оценены с точки зрения объема и количества клеток. Объемы биопленки могут быть количественно определены путем окрашивания с помощью кристаллического фиолетового, промывки, обесцвечивания с использованием этанола, а затем измерения солюбилизированного красителя с помощью микропланшетного ридера. Чтобы количественно определить количество клеток, встроенных в биопленки, биопленки соскребают с помощью клеточных скребков, собирают в физиологическом растворе, энергично перемешивают в присутствии стеклянных шариков и наносят на агар Acinetobacter. Затем планшеты инкубируют при 30 °C в течение 24-42 ч. После инкубации красные колонии нумеруются, чтобы оценить количество клеток в биопленках. Этот жизнеспособный метод подсчета также может быть полезен для подсчета клеток Acinetobacter в биопленках смешанных видов. Биопленки Acinetobacter можно визуализировать с помощью флуоресцентных красителей. Коммерчески доступная микропланшет, предназначенная для микроскопического анализа, используется для формирования биопленок. Затем биопленки, прикрепленные к нижней поверхности, окрашивают красителями SYTO9 и пропидидом пропидия, промывают и визуализируют с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.
Introduction
Известно, что Acinetobacter вызывает внутрибольничные инфекции, и всечаще регистрируется заражение людей, особенно в медицинских учреждениях1. Он широко распространен в больницах, медицинских учреждениях и пищевых продуктах 2,3,4. Он может выживать в течение длительного периода времени в различных средах, включая больничные поверхности, такие как поручни кроватей, прикроватные тумбочки, поверхность аппаратов искусственной вентиляции легких и раковины4. Такая персистенция на поверхностях окружающей среды может быть одним из существенных факторов, способствующих внутрибольничным инфекциям Acinetobacter4.
Биопленка представляет собой форму микробной жизни и представляет собой микробный матрикс, состоящий из живых микробных клеток и внеклеточных полимерных веществ (ЭПС) из клеток5. Микробные клетки встроены в матрикс и часто обладают высокой устойчивостью к воздействиям окружающей среды, таким как жара, соли, сухость, антибиотики, дезинфицирующие средства и силы сдвига 6,7.
Acinetobacter может образовывать биопленки на поверхностях, что позволяет предположить, что он может способствовать увеличению выживаемости на поверхностях окружающей среды, включая больничные поверхности, и повышению устойчивости к лечению антибиотиками 8,9. Кроме того, образование биопленки Acinetobacter может быть тесно связано с клиническими исходами у человека8. Таким образом, формуемость биопленки штаммов Acinetobacter может быть одним из показателей в прогнозировании экологической выживаемости и инфекций человека 8,10.
Биопленки, прикрепленные к поверхности, могут быть количественно оценены и визуализированы для оценки формуемости биопленки. Для количественного определения прикрепленных к поверхности биопленок биопленки обычно окрашивают красителями, окрашивающими биопленку, такими как кристаллический фиолетовый, а красители элюируют в растворе и измеряют оптическую плотность11. Визуализация биопленок является еще одним хорошим подходом к оценке формуемости биопленки11. Метод визуализации с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM), использующий специфичность с использованием флуоресцентных красителей, может быть более полезным для характеристики морфологии биопленки по сравнению с другими методами, такими как SEM12,13.
Количество жизнеспособных клеток в биопленках можно подсчитать, чтобы оценить количество жизнеспособных клеток в биопленках11. Жизнеспособные клетки, встроенные в биопленки, отделяют, разбавляют, распределяют по агаровым пластинам, инкубируют и нумеруют. Поскольку большее количество клеток, вероятно, соответствует инфекционной дозе, это может предоставить более подробную информацию о биопленках, например, о потенциале инфекции, связанном с количеством клеток13,14.
В этой статье представлены пошаговые протоколы для (1) количественной оценки поверхностно-прикрепленных биопленок, (2) подсчета жизнеспособных клеток в биопленках и (3) визуализации биопленок с помощью CLSM Acinetobacter. В представленных протоколах описаны методы оценки формуемости биопленки изолятов Acinetobacter и характеристика их биопленок.
Protocol
Representative Results
Discussion
С помощью описанного протокола измеряли, визуализировали биопленкообразование изолятов Acinetobacter в разной степени и оценивали жизнеспособные клетки в биопленках (рис. 1, рис. 2 и рис. 3).
В этом протоколе использовались дв…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Основной исследовательской программой (E0210702-03) Корейского научно-исследовательского института пищевых продуктов (KFRI), финансируемой Министерством науки и ИКТ.
Materials
| 96-well cell culture plate | SPL | 30096 | Polystyrene 96-well plate |
| BHI (Brain Heart Infusion) broth | Merck KGaA | 1.10493.0500 | |
| Blood Agar Base Plate | KisanBio | MB-B1005-P50 | Growth media for Acinetobacter |
| CHROMagar Acinetobacter | CHROMagar | AC092 | Selective plate for Acinetobacter |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | V5265 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit | Invitrogen | L10316 | SYTO9 and propidium iodide |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO NanoQuant | Biofilm measurement |
| RBC Glass Plating Beads | RBC | RG001 | Glass beads |
| μ-Plate 96 Well Black | ibidi | 89621 | Microplate intended for CLSM |
References
- Wong, D., et al. Clinical and pathophysiological overview of Acinetobacter infections: a century of challenges. Clinical Microbiology Reviews. 30 (1), 409-447 (2017).
- Carvalheira, A., Silva, J., Teixeira, P. Acinetobacter spp. in food and drinking water – A review. Food Microbiology. 95, 103675 (2021).
- Towner, K. J. Acinetobacter: an old friend, but a new enemy. Journal of Hospital Infection. 73 (4), 355-363 (2009).
- Weber, D. J., Rutala, W. A., Miller, M. B., Huslage, K., Sickbert-Bennett, E. Role of hospital surfaces in the transmission of emerging health care-associated pathogens: Norovirus, Clostridium difficile, and Acinetobacter species. American Journal of Infection Control. 38 (5), S25-S33 (2010).
- Flemming, H. C., et al. The biofilm matrix: multitasking in a shared space. Nature Reviews Microbiology. 21 (2), 70-86 (2023).
- Flemming, H. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).
- Yin, W., Wang, Y., Liu, L., He, J. Biofilms: the microbial "protective clothing" in extreme environments. International Journal of Molecular Sciences. 20 (14), 3423 (2019).
- Gedefie, A., et al. Acinetobacter baumannii biofilm formation and its role in disease pathogenesis: a review. Infection and drug resistance. 14, 3711-3719 (2021).
- Whiteway, C., Breine, A., Philippe, C., Van der Henst, C. Acinetobacter baumannii. Trends in Microbiology. 30 (2), 199-200 (2022).
- Longo, F., Vuotto, C., Donelli, G. Biofilm formation in Acinetobacter baumannii. New Microbiologica. 37 (2), 119-127 (2014).
- Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
- Jia, J., Xue, X., Guan, Y., Fan, X., Wang, Z. Biofilm characteristics and transcriptomic profiling of Acinetobacter johnsonii defines signatures for planktonic and biofilm cells. Environmental Research. 213, 113714 (2022).
- Yang, C., Su, P., Moi, S., Chuang, L. Biofilm formation in Acinetobacter baumannii: genotype-phenotype correlation. Molecules. 24 (10), 1849 (2019).
- Alamri, A. M., Alsultan, A. A., Ansari, M. A., Alnimr, A. M. Biofilm-formation in clonally unrelated multidrug-resistant Acinetobacter baumannii isolates. Pathogens. 9 (8), 630 (2020).
- Lim, E. S., Nam, S. J., Koo, O. K., Kim, J. S. Protective role of Acinetobacter and Bacillus for Escherichia coli O157:H7 in biofilms against sodium hypochlorite and extracellular matrix-degrading enzymes. Food Microbiology. 109, 104125 (2023).
- Stepanović, S., Ćirković, I., Ranin, L., Svabić-Vlahović, M. Biofilm formation by Salmonella spp. and Listeria monocytogenes on plastic surface. Letters in Applied Microbiology. 38 (5), 428-432 (2004).
- Boone, R. L., et al. Analysis of virulence phenotypes and antibiotic resistance in clinical strains of Acinetobacter baumannii isolated in Nashville, Tennessee. BMC Microbiology. 21 (1), 21 (2021).
- Otter, J. A., et al. Surface-attached cells, biofilms and biocide susceptibility: implications for hospital cleaning and disinfection. Journal of Hospital Infection. 89 (1), 16-27 (2015).
- Ravishankar, S., Juneja, V. K., Yousef, A. E., Juneja, V. K. Adaptation or resistance responses of microorganisms to stresses in the food processing environment. Microbial Stress Adaptation and Food Safety. , (2003).
- Dewanti, R., Wong, A. C. L. Influence of culture conditions on biofilm formation by Escherichia coli O157:H7. International Journal of Food Microbiology. 26 (2), 147-164 (1995).
- McConnell, M. J., Actis, L., Pachón, J. Acinetobacter baumannii: human infections, factors contributing to pathogenesis and animal models. FEMS Microbiology Reviews. 37 (2), 130-155 (2013).
- McQueary, C. N., Actis, L. A. Acinetobacter baumannii biofilms: variations among strains and correlations with other cell properties. The Journal of Microbiology. 49 (2), 243-250 (2011).
