Summary

Análise Multiômica de TMEM200A como Biomarcador Pan-Câncer

Published: September 15, 2023
doi:

Summary

Aqui, é apresentado um protocolo no qual múltiplas ferramentas de bioinformática são combinadas para estudar as funções biológicas da TMEM200A no câncer. Além disso, também validamos experimentalmente as previsões de bioinformática.

Abstract

A proteína transmembrana, TMEM200A, é conhecida por estar associada a cânceres humanos e infiltração imunológica. Aqui, avaliamos a função da TMEM200A em cânceres comuns por meio de análise multiômica e usamos culturas de células gástricas in vitro para verificar os resultados. A expressão de TMEM200A em vários tipos de câncer humano foi avaliada usando os dados de RNA-seq do banco de dados UCSC Xena. A análise bioinformática revelou um papel potencial da TMEM200A como biomarcador diagnóstico e prognóstico.

Culturas de linhagens normais de células gástricas e cancerígenas foram cultivadas e TMEM200A foi derrubada. Os níveis de expressão de TMEM200A foram medidos usando reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real e western blotting. Estudos in vitro de perda de função foram então utilizados para determinar o papel da TMEM200A no comportamento maligno e na formação tumoral de células de câncer gástrico (GC). Western blots foram utilizados para avaliar o efeito do knockdown na transição epitélio-mesenquimal (EMT) e na via de sinalização PI3K/AKT no GC. A análise bioinformática mostrou que TMEM200A foi expressa em níveis elevados no GC.

A proliferação de células GC foi inibida por knockdown TMEM200A , que também diminuiu as proteínas vimentina, N-caderina e Snai e inibiu a fosforilação de AKT. A via de sinalização PI3K/AKT também parece estar envolvida na regulação mediada por TMEM200A do desenvolvimento de GC. Os resultados aqui apresentados sugerem que TMEM200A regula o microambiente tumoral afetando a EMT. TMEM200A também podem afetar a EMT através da sinalização PI3K/AKT, influenciando o microambiente tumoral. Portanto, em pan-cânceres, especialmente GC, TMEM200A pode ser um potencial biomarcador e oncogene.

Introduction

O câncer tem emergido como um problema persistente de saúde pública que coloca em risco a saúde humana em todo o mundo1devido às suas altas taxas de morbidade e mortalidade em todo o mundo, representando um pesado fardo financeiro e médico para a sociedade2. Avanços significativos na terapia do câncer foram alcançados nos últimos anos graças à descoberta de marcadores de câncer3, e os pesquisadores desenvolveram novos métodos diagnósticos e novas drogas para tratar o câncer. No entanto, alguns pacientes com câncer ainda apresentam prognóstico ruim devido a fatores como resistência aos medicamentos, efeitos colaterais dos fármacos e sensibilidade química4. Portanto, há uma necessidade urgente de identificação de novos biomarcadores para o rastreamento e tratamento de cânceres em estádio inicial5.

As proteínas de membrana são proteínas que podem se ligar e se integrar às células e membranas organelas6. Estas podem ser agrupadas em três categorias, dependendo da força de ligação à membrana e de sua localização: proteínas ancoradas a lipídios, proteínas íntegras e proteínas de membrana periférica 7,8. Uma proteína transmembrana (TMEM) é uma proteína de membrana integral que consiste em pelo menos um segmento transmembrana9, que passa total ou parcialmente através da membrana biológica.

Embora os mecanismos de ação das proteínas pertencentes à família TMEM não sejam bem compreendidos, sabe-se que essas proteínas estão envolvidas em vários tipos decâncer10. Várias proteínas TMEM estão associadas a fenótipos migratórios, proliferativos e invasivos, e sua expressão está frequentemente associada ao prognóstico do paciente11. Portanto, os membros da família TMEM tornaram-se alvo de pesquisa. Uma revisão abrangente dos relatos existentes sobre TMEM revelou que eles estão principalmente associados à sinalização inter e intracelular12, doenças relacionadas à imunidade e tumorigênese10. Muitos TMEMs também possuem funções fisiológicas importantes, por exemplo, canais iônicos na membrana plasmática, ativação de vias de transdução de sinal, bem como a mediação da quimiotaxia celular, adesão, apoptose e autofagia10. Portanto, levantamos a hipótese de que as proteínas TMEM podem ser importantes marcadores prognósticos na detecção e tratamento de tumores.

TMEM200A expressão é significativamente elevada no câncer gástrico (GC). A maior expressão do TMEM200A13, que possui oito exons e comprimento total de 77,536 kb no cromossomo 6q23.1, tem sido associada a um mau prognóstico de sobrevida global (SG) em casos de CG. No entanto, as alterações em sua expressão têm sido raramente relatadas em estudos oncológicos. Este artigo compara e analisa a utilidade do TMEM200A como alvo terapêutico e marcador diagnóstico tumoral em vários estudos de câncer usando diferentes conjuntos de dados disponíveis publicamente. Avaliamos a eficácia do TMEM200A como um biomarcador diagnóstico e prognóstico pan-câncer, bem como seus níveis de expressão em vários tipos de câncer humano usando dados de RNA-seq dos bancos de dados UCSC Xena e TCGA, bem como por reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR) e western blotting.

O efeito dos níveis de expressão de TMEM200A sobre as taxas de mutação, processos regulatórios, diagnóstico e prognóstico tumoral, infiltração imune e imunoterapia foi investigado usando uma mistura de ferramentas computacionais e sites de conjunto de dados. Os bancos de dados CBioPortal e Catalog of Somatic Mutations in Cancer Cells (COSMIC) foram usados para examinar mutações em TMEM200A. Os sites Sangerbox e TISIDB foram utilizados para entender como TMEM200A influencia a infiltração imunológica. A ferramenta on-line Tumor Immune Single Cell Center (TISCH) e o banco de dados CancerSEA foram usados para investigar a função do TMEM200A. Finalmente, para avaliar o impacto da TMEM200A sobre o comportamento maligno e a função de desenvolvimento tumoral das células GC, um experimento de perda de função foi conduzido em um ensaio in vitro . Adicionalmente, o western blotting foi realizado para avaliar como TMEM200A knockdown afetou a via de sinalização PI3K/AKT e a transição epitélio-mesenquimal (EMT) no GC.

Protocol

1. O banco de dados do Atlas do Genoma do Câncer (TCGA) NOTA: O banco de dados do Atlas do Genoma do Câncer (TCGA) contém os dados de sequenciamento de genes em diferentes tecidos tumorais14. Dados de RNA-seq em TCGA para o estudo de TMEM200A transcritos por parte por milhão (TPM) foram extraídos do site UCSC Xena 15 (https://xenabrowser. net/datapages/) e transformados log2 para comp…

Representative Results

Expressão de TMEM200A em vários tipos de câncerComo ilustrado na Figura 1, primeiramente analisamos os níveis de expressão diferencial de TMEM200A em vários cânceres através de diferentes bancos de dados. TMEM200A expressão foi elevada no colangiocarcinoma (CHOL), carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço (HNSC), carcinoma de células claras renal (KIRC), carcinoma de células papilíferos renais (KIRP), carcinoma …

Discussion

TMEM200A pertence a uma família de TMEMs que é essencial para que as células cancerosas proliferem38. A expressão variável de TMEM200A em diferentes neoplasias malignas tem recebido menos atenção, e uma investigação completa do pan-câncer está faltando. No entanto, evidências continuam a se acumular, mostrando que a família de proteínas transmembrana TMEM pode ser importante na manutenção de células cancerosas malignas por meio de interações com várias proteí…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82160550).

Materials

Anti-AKT antibody Proteintech Group, Inc 60203-2-Ig
Anti-E-cadherin antibody Proteintech Group, Inc 20874-1-AP
anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) antibody Proteintech Group, Inc 10494-1-AP
Anti-N-cadherin antibody Proteintech Group, Inc 22018-1-AP
Anti-P-AKT antibody Proteintech Group, Inc 66444-1-Ig
Anti-snail antibody Proteintech Group, Inc 13099-1-AP
Anti-Vimentin antibody Proteintech Group, Inc 10366-1-AP
AxyPrepMultisourceTotalRNAMini-
prep Kit
Suzhou Youyi Landi Biotechnology Co., Ltd UEL-UE-MN-MS-RNA-50G
BCA Protein Assay Kit Epizyme Biotech ZJ101L
CCK-8 reagent MedChemExpress HY-K0301-500T
Fetal bovine serum (FBS) CYAGEN BIOSCIENCES (GUANGZHOU) INC FBSSR-01021
GAPDH primer Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. Forward primer (5’-3’): TGACATCAAGAAGGTG
GTGAAGCAG; Reverse primer (5’-3’): GTGTCGCTGTTGAAG
TCAGAGGAG
HighGene plus Transfection reagent ABclonal RM09014P
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG (H+L) Proteintech Group, Inc SA00001-1
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit lgG (H+L) Proteintech Group, Inc SA00001-2
Human gastric mucosal epithelial GES-1 cells Guangzhou Cellcook Biotech Co.,Ltd.
Human STAD HGC-27 cells Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
Human STAD SGC-7901 cells Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
MonAmp SYBR Green qPCR Mix (None ROX) Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd MQ10101S
MonScript RTIII All-in-One Mix with dsDNase   Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd MR05101M
Omni-ECL Femto Light Chemiluminescence Kit Epizyme Biotech SQ201
PAGE Gel Fast Preparationb Kit  Epizyme Biotech PG111
Penicillin-streptomycin (Pen-Strep) Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd P1400-100
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane Merck KGaA IPVH00010-1
Protein Free Rapid Blocking Buffer Epizyme Biotech PS108P
RIPA lysis solution Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd R0010
RPMI 1640 complete medium Thermo Fisher Scientific C11875500BT
Skimmed milk Campina: Elk
TBST buffer solution Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd T1082
The protein loading buffer Epizyme Biotech LT101S
TMEM200A knockdown plasmid MiaoLing Plasmid
TMEM200A primer Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. Forward primer (5’-3’): AAGGCGGTGTGGTGGTTCG; Reverse primer (5’-3’): GATTTTGGTCTCTTTGTCACGGTT
TMEM200A SiRNA1 MiaoLing Plasmid Forward primer (5’-3’): ACAACTGATGATAAGACCAG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGACTACTATTCTGGTC
TMEM200A SiRNA2 MiaoLing Plasmid Forward primer (5’-3’): CGTGTGAATGTCAATGACTG; Reverse primer (5’-3’): GCACACTTACAGTTACTGAC
TMEM200A SiRNA3 MiaoLing Plasmid Forward primer (5’-3’): ACAACCACAACATCTGCCCG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGGTGTTGTAGACGGGC
Transmembrane protein 200A Antibody Proteintech Group, Inc 48081-1
Equipment
CO2 cell culture incubator Haier Group PYXE-80IR
Electrophoresis instrument Bio-RAD
Fluorescence quantitative PCR instrument Bio-RAD
Gel Imaging System (Tanon 5200) Tanon Science & Technology Co., Ltd LAB-0002-0007-SHTN
Multifunctional Enzyme Labeler Berthold

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Cite This Article
Zhang, Y., Kuang, S., Qin, H., Zhao, N., Yang, Y., Xie, J. Multiomics Analysis of TMEM200A as a Pan-Cancer Biomarker. J. Vis. Exp. (199), e65795, doi:10.3791/65795 (2023).

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