Summary

Pan-Kanser Biyobelirteci Olarak TMEM200A'in Multiomik Analizi

Published: September 15, 2023
doi:

Summary

Burada, kanserde TMEM200A biyolojik fonksiyonlarını incelemek için çoklu biyoinformatik araçların birleştirildiği bir protokol sunulmaktadır. Ek olarak, biyoinformatik tahminleri deneysel olarak da doğruluyoruz.

Abstract

TMEM200A transmembran proteinin insan kanserleri ve immün infiltrasyon ile ilişkili olduğu bilinmektedir. Burada, yaygın kanserlerde TMEM200A fonksiyonunu multiomik analiz ile değerlendirdik ve sonuçları doğrulamak için mide hücrelerinin in vitro hücre kültürlerini kullandık. Çeşitli insan kanser türlerinde TMEM200A ekspresyonu, UCSC Xena veri tabanından alınan RNA-seq verileri kullanılarak değerlendirildi. Biyoinformatik analiz, TMEM200A’in tanısal ve prognostik bir biyobelirteç olarak potansiyel bir rolünü ortaya koymuştur.

Normal mide ve kanser hücre hatlarının kültürleri büyütüldü ve TMEM200A yıkıldı. TMEM200A ekspresyon düzeyleri kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu ve western blotlama kullanılarak ölçüldü. Daha sonra mide kanseri (GC) hücrelerinin malign davranışı ve tümör oluşumunda TMEM200A rollerini belirlemek için in vitro fonksiyon kaybı çalışmaları kullanıldı. Yıkımın GC’de epitelyal-mezenkimal geçiş (EMT) ve PI3K/AKT sinyal yolu üzerindeki etkisini değerlendirmek için Western blotları kullanıldı. Biyoinformatik analiz, TMEM200A GC’de yüksek düzeyde eksprese edildiğini göstermiştir.

GC hücrelerinin proliferasyonu, vimentin, N-kaderin ve Snai proteinlerini de azaltan ve AKT fosforilasyonunu inhibe eden TMEM200A yıkımı ile inhibe edildi. PI3K/AKT sinyal yolunun, GC gelişiminin TMEM200A aracılı düzenlenmesinde de rol oynadığı görülmüştür. Burada sunulan sonuçlar , TMEM200A’in EMT’yi etkileyerek tümör mikroçevresini düzenlediğini göstermektedir. TMEM200A ayrıca PI3K / AKT sinyali yoluyla EMT’yi etkileyebilir, böylece tümör mikroçevresini etkileyebilir. Bu nedenle, pan-kanserlerde, özellikle GC’de, TMEM200A potansiyel bir biyobelirteç ve onkogen olabilir.

Introduction

Kanser, dünya çapında yüksek morbidite ve mortalite oranları nedeniyleküresel olarak insan sağlığını tehlikeye atan kalıcıbir halk sağlığı sorunu olarak ortaya çıkmıştır1 ve topluma ağır bir mali ve tıbbi yük oluşturmaktadır 2. Kanser belirteçlerininkeşfi sayesinde son yıllarda kanser tedavisinde önemli ilerlemeler kaydedilmiştir 3 ve araştırmacılar kanseri tedavi etmek için yeni tanı yöntemleri ve yeni ilaçlar geliştirmiştir. Bununla birlikte, kanserli bazı hastalar, ilaç direnci, ilaçların yan etkileri ve kimyasal duyarlılık gibi faktörler nedeniyle hala kötü prognoza sahiptir4. Bu nedenle, erken evre kanserlerin taranması ve tedavisi için yeni biyobelirteçlerin belirlenmesine acil ihtiyaç vardır5.

Zar proteinleri, hücrelere ve organel zarlarınabağlanabilen ve entegre olabilen proteinlerdir 6. Bunlar, zara bağlanma gücüne ve konumlarına bağlı olarak üç kategoride gruplandırılabilir: lipid bağlantılı proteinler, integral proteinler ve periferik zar proteinleri 7,8. Bir transmembran (TMEM) proteini, biyolojik membrandan tamamen veya kısmen geçen en az bir transmembran segment9’dan oluşan entegre bir membran proteinidir.

TMEM ailesine ait proteinlerin etki mekanizmaları tam olarak anlaşılamamış olsa da, bu proteinlerin çeşitli kanser türlerinde rol oynadığı bilinmektedir10. Birkaç TMEM proteini göçmen, proliferatif ve invaziv fenotiplerle ilişkilidir ve ekspresyonu genellikle hastanın prognozuile ilişkilidir 11. Bu nedenle TMEM ailesi üyeleri araştırmaların hedefi haline gelmiştir. TMEM ile ilgili mevcut raporların kapsamlı bir incelemesi, bunların çoğunlukla hücreler arası ve hücre içi sinyal12, bağışıklık ile ilişkili hastalıklar ve tümöroluşumu 10 ile ilişkili olduğunu ortaya koymuştur. Birçok TMEM ayrıca, örneğin plazma zarındaki iyon kanalları, sinyal iletim yollarının aktivasyonu ve ayrıca hücre kemotaksisi, adezyon, apoptoz ve otofajinin aracılık etmesi gibi önemli fizyolojik işlevlere sahiptir10. Bu nedenle, TMEM proteinlerinin tümörlerin saptanması ve tedavisinde önemli prognostik belirteçler olabileceğini varsaydık.

TMEM200A ekspresyonu mide kanserinde (GK) önemli ölçüde yüksektir. Kromozom 6q23.1 üzerinde sekiz ekzon ve tam uzunluğu 77.536 kb olan TMEM200A13’ün daha yüksek ekspresyonu, GC vakalarında genel sağkalım (OS) için kötü bir prognoz ile ilişkilendirilmiştir. Yine de ekspresyonundaki değişiklikler onkoloji çalışmalarında nadiren bildirilmiştir. Bu makale, halka açık farklı veri kümelerini kullanarak çeşitli kanser çalışmalarında terapötik bir hedef ve tümör tanı belirteci olarak TMEM200A’in yararlılığını karşılaştırmakta ve analiz etmektedir. UCSC Xena ve TCGA veri tabanlarından RNA-seq verilerinin yanı sıra gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) ve western blotlama kullanarak pan-kanser tanısal ve prognostik bir biyobelirteç olarak TMEM200A’nin etkinliğini ve çeşitli insan kanseri türlerinde ekspresyon seviyelerini değerlendirdik.

TMEM200A ekspresyon seviyelerinin mutasyon oranları, düzenleyici süreçler, tümör teşhisi ve prognozu, immün infiltrasyon ve immünoterapi üzerindeki etkisi, hesaplama araçları ve veri seti web sitelerinin bir karışımı kullanılarak daha fazla araştırıldı. TMEM200A’deki mutasyonları incelemek için CBioPortal ve Kanser Hücrelerinde Somatik Mutasyonlar Kataloğu (COSMIC) veri tabanları kullanıldı. TMEM200A immün infiltrasyonu nasıl etkilediğini anlamak için Sangerbox ve TISIDB web siteleri kullanıldı. TMEM200A işlevini araştırmak için Tümör İmmün Tek Hücre Merkezi (TISCH) çevrimiçi aracı ve CancerSEA veritabanı kullanıldı. Son olarak, TMEM200A’in GC hücrelerinin malign davranışı ve tümör gelişim fonksiyonu üzerindeki etkisini değerlendirmek için, bir in vitro testte bir fonksiyon kaybı deneyi yapıldı. Ek olarak, TMEM200A yıkımın PI3K/AKT sinyal yolunu ve GC’deki epitelyal-mezenkimal geçişi (EMT) nasıl etkilediğini değerlendirmek için western blotlama yapıldı.

Protocol

1. Kanser Genom Atlası (TCGA) veritabanı NOT: Kanser Genom Atlası (TCGA) veri tabanı, farklı tümör dokularındaki genlerin dizileme verilerini içerir14. Milyonda parça başına TMEM200A transkript (TPM) formatlarının incelenmesi için TCGA’daki RNA-seq verileri, UCSC Xena web sitesinden15 (https://xenabrowser. net/datapages/) çıkarıldı ve log2, örnekler arasındaki ifadeler…

Representative Results

Çeşitli kanserlerde TMEM200A ekspresyonuŞekil 1’de gösterildiği gibi, ilk olarak farklı veri tabanları aracılığıyla çeşitli kanserlerde TMEM200A diferansiyel ekspresyon seviyelerini analiz ettik. Kolanjiokarsinom (CHOL), baş ve boyun skuamöz hücreli karsinomu (HNSC), renal berrak hücreli karsinom (KIRC), renal papiller hücreli karsinom (KIRP), hepatosellüler karsinom (LIHC), STAD ve tiroid karsinomunda (THC…

Discussion

TMEM200A , kanser hücrelerinin çoğalması için gerekli olan bir TMEM ailesine aittir38. Farklı malignitelerde TMEM200A’nin değişken ekspresyonu daha az dikkat çekmiştir ve kapsamlı bir pan-kanser araştırması eksiktir. Bununla birlikte, TMEM transmembran protein ailesinin, çeşitli proteinlerle etkileşimler yoluyla kanser hücrelerini kötü huylu tutmada önemli olabileceğini gösteren kanıtlar birikmeye devam ediyor, örneğin, TMEM16A Ca2+ ile aktive…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82160550) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Anti-AKT antibody Proteintech Group, Inc 60203-2-Ig
Anti-E-cadherin antibody Proteintech Group, Inc 20874-1-AP
anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) antibody Proteintech Group, Inc 10494-1-AP
Anti-N-cadherin antibody Proteintech Group, Inc 22018-1-AP
Anti-P-AKT antibody Proteintech Group, Inc 66444-1-Ig
Anti-snail antibody Proteintech Group, Inc 13099-1-AP
Anti-Vimentin antibody Proteintech Group, Inc 10366-1-AP
AxyPrepMultisourceTotalRNAMini-
prep Kit
Suzhou Youyi Landi Biotechnology Co., Ltd UEL-UE-MN-MS-RNA-50G
BCA Protein Assay Kit Epizyme Biotech ZJ101L
CCK-8 reagent MedChemExpress HY-K0301-500T
Fetal bovine serum (FBS) CYAGEN BIOSCIENCES (GUANGZHOU) INC FBSSR-01021
GAPDH primer Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. Forward primer (5’-3’): TGACATCAAGAAGGTG
GTGAAGCAG; Reverse primer (5’-3’): GTGTCGCTGTTGAAG
TCAGAGGAG
HighGene plus Transfection reagent ABclonal RM09014P
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG (H+L) Proteintech Group, Inc SA00001-1
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit lgG (H+L) Proteintech Group, Inc SA00001-2
Human gastric mucosal epithelial GES-1 cells Guangzhou Cellcook Biotech Co.,Ltd.
Human STAD HGC-27 cells Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
Human STAD SGC-7901 cells Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
MonAmp SYBR Green qPCR Mix (None ROX) Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd MQ10101S
MonScript RTIII All-in-One Mix with dsDNase   Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd MR05101M
Omni-ECL Femto Light Chemiluminescence Kit Epizyme Biotech SQ201
PAGE Gel Fast Preparationb Kit  Epizyme Biotech PG111
Penicillin-streptomycin (Pen-Strep) Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd P1400-100
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane Merck KGaA IPVH00010-1
Protein Free Rapid Blocking Buffer Epizyme Biotech PS108P
RIPA lysis solution Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd R0010
RPMI 1640 complete medium Thermo Fisher Scientific C11875500BT
Skimmed milk Campina: Elk
TBST buffer solution Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd T1082
The protein loading buffer Epizyme Biotech LT101S
TMEM200A knockdown plasmid MiaoLing Plasmid
TMEM200A primer Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. Forward primer (5’-3’): AAGGCGGTGTGGTGGTTCG; Reverse primer (5’-3’): GATTTTGGTCTCTTTGTCACGGTT
TMEM200A SiRNA1 MiaoLing Plasmid Forward primer (5’-3’): ACAACTGATGATAAGACCAG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGACTACTATTCTGGTC
TMEM200A SiRNA2 MiaoLing Plasmid Forward primer (5’-3’): CGTGTGAATGTCAATGACTG; Reverse primer (5’-3’): GCACACTTACAGTTACTGAC
TMEM200A SiRNA3 MiaoLing Plasmid Forward primer (5’-3’): ACAACCACAACATCTGCCCG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGGTGTTGTAGACGGGC
Transmembrane protein 200A Antibody Proteintech Group, Inc 48081-1
Equipment
CO2 cell culture incubator Haier Group PYXE-80IR
Electrophoresis instrument Bio-RAD
Fluorescence quantitative PCR instrument Bio-RAD
Gel Imaging System (Tanon 5200) Tanon Science & Technology Co., Ltd LAB-0002-0007-SHTN
Multifunctional Enzyme Labeler Berthold

References

  1. Torre, L. A., Siegel, R. L., Ward, E. M., Jemal, A. Global cancer incidence and mortality rates and trends–an update. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 25 (1), 16-27 (2016).
  2. Long, X., et al. Economic burden of malignant tumors – Yichang City, Hubei Province, China, 2019. China CDC Wkly. 4 (15), 312-316 (2022).
  3. Harbeck, N., Gnant, M. Breast cancer. Lancet. 389 (10074), 1134-1150 (2017).
  4. Bagchi, S., Yuan, R., Engleman, E. G. Immune checkpoint inhibitors for the treatment of cancer: clinical impact and mechanisms of response and resistance. Annu Rev Pathol. 16, 223-249 (2021).
  5. Lam, G. T., et al. Pitfalls in cutaneous melanoma diagnosis and the need for new reliable markers. Mol Diagn Ther. 27 (1), 49-60 (2023).
  6. Gromiha, M. M., Ou, Y. Y. Bioinformatics approaches for functional annotation of membrane proteins. Brief Bioinform. 15 (2), 155-168 (2014).
  7. Schmit, K., Michiels, C. TMEM proteins in cancer: a review. Front Pharmacol. 9, 1345 (2018).
  8. Marx, S., et al. Transmembrane (TMEM) protein family members: Poorly characterized even if essential for the metastatic process. Semin Cancer Biol. 60, 96-106 (2020).
  9. Fu, K., et al. Overexpression of transmembrane protein 168 in the mouse nucleus accumbens induces anxiety and sensorimotor gating deficit. PLoS One. 12 (12), e0189006 (2017).
  10. Cuajungco, M. P., et al. Abnormal accumulation of human transmembrane (TMEM)-176A and 176B proteins is associated with cancer pathology. Acta Histochem. 114 (7), 705-712 (2012).
  11. Zhang, S., et al. TMEM116 is required for lung cancer cell motility and metastasis through PDK1 signaling pathway. Cell Death Dis. 12 (12), 1086 (2021).
  12. Zhang, N., Pan, H., Liang, X., Xie, J., Han, W. The roles of transmembrane family proteins in the regulation of store-operated Ca(2+) entry. Cell Mol Life Sci. 79 (2), 118 (2022).
  13. Zhang, X., Zheng, P., Li, Z., Gao, S., Liu, G. The somatic mutation landscape and RNA prognostic markers in stomach adenocarcinoma. Onco Targets Ther. 13, 7735-7746 (2020).
  14. Jia, D., et al. Mining TCGA database for genes of prognostic value in glioblastoma microenvironment. Aging (Albany NY). 10 (4), 592-605 (2018).
  15. Wang, S., et al. UCSCXenaShiny: an R/CRAN package for interactive analysis of UCSC Xena data. Bioinformatics. 38 (2), 527-529 (2022).
  16. Li, T., et al. TIMER2.0 for analysis of tumor-infiltrating immune cells. Nucleic Acids Res. 48 (W1), W509-W514 (2020).
  17. Thul, P. J., et al. A subcellular map of the human proteome. Science. 356 (6340), eaal3321 (2017).
  18. Li, Y., Ge, D., Lu, C. The SMART App: an interactive web application for comprehensive DNA methylation analysis and visualization. Epigenetics Chromatin. 12 (1), 71 (2019).
  19. Chandrashekar, D. S., et al. UALCAN: An update to the integrated cancer data analysis platform. Neoplasia. 25, 18-27 (2022).
  20. Tate, J. G., et al. COSMIC: the Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer. Nucleic Acids Res. 47 (D1), D941-D947 (2019).
  21. Gao, J., et al. Integrative analysis of complex cancer genomics and clinical profiles using the cBioPortal. Sci Signal. 6 (269), pl1 (2013).
  22. Shen, W., et al. Sangerbox: A comprehensive, interaction-friendly clinical bioinformatics analysis platform. iMeta. 1 (3), e36 (2022).
  23. Ru, B., et al. TISIDB: an integrated repository portal for tumor-immune system interactions. Bioinformatics. 35 (20), 4200-4202 (2019).
  24. Yuan, H., et al. CancerSEA: a cancer single-cell state atlas. Nucleic Acids Res. 47 (D1), D900-D908 (2019).
  25. Sun, D., et al. TISCH: a comprehensive web resource enabling interactive single-cell transcriptome visualization of tumor microenvironment. Nucleic Acids Res. 49 (D1), D1420-D1430 (2021).
  26. Warde-Farley, D., et al. The GeneMANIA prediction server: biological network integration for gene prioritization and predicting gene function. Nucleic Acids Res. 38, W214-W220 (2010).
  27. Zhu, Y., Feng, S., Song, Z., Wang, Z., Chen, G. Identification of immunological characteristics and immune subtypes based on single-sample gene set enrichment analysis algorithm in lower-grade glioma. Front Genet. 13, 894865 (2022).
  28. Mueller Bustin, S. A., R, Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clin Sci (Lond). 109 (4), 365-379 (2005).
  29. Sun, L., Zhang, H., Gao, P. Metabolic reprogramming and epigenetic modifications on the path to cancer. Protein Cell. 13 (12), 877-919 (2022).
  30. Ntontsi, P., Photiades, A., Zervas, E., Xanthou, G., Samitas, K. Genetics and epigenetics in asthma. Int J Mol Sci. 22 (5), 2412 (2021).
  31. Martínez-Reyes, I., Chandel, N. S. Cancer metabolism: looking forward. Nat Rev Cancer. 21 (10), 669-680 (2021).
  32. Chen, Y., et al. PremPS: Predicting the impact of missense mutations on protein stability. PLoS Comput Biol. 16 (12), e1008543 (2020).
  33. Li, M., Petukh, M., Alexov, E., Panchenko, A. R. Predicting the impact of missense mutations on protein-protein binding affinity. J Chem Theory Comput. 10 (4), 1770-1780 (2014).
  34. Hirsch, D., et al. Clinical responses to PD-1 inhibition and their molecular characterization in six patients with mismatch repair-deficient metastatic cancer of the digestive system. J Cancer Res Clin Oncol. 147 (1), 263-273 (2021).
  35. Poulogiannis, G., Frayling, I. M., Arends, M. J. DNA mismatch repair deficiency in sporadic colorectal cancer and Lynch syndrome. Histopathology. 56 (2), 167-179 (2010).
  36. Chintamani, J., et al. The expression of mismatched repair genes and their correlation with clinicopathological parameters and response to neo-adjuvant chemotherapy in breast cancer. Int Semin Surg Oncol. 4, 5 (2007).
  37. Deng, H., et al. High expression of TMEM200A is associated with a poor prognosis and immune infiltration in gastric cancer. Pathol Oncol Res. 29, 1610893 (2023).
  38. Stemmler, M. P. Cadherins in development and cancer. Mol Biosyst. 4 (8), 835-850 (2008).
  39. Bill, A., et al. ANO1/TMEM16A interacts with EGFR and correlates with sensitivity to EGFR-targeting therapy in head and neck cancer. Oncotarget. 6 (11), 9173-9188 (2015).
  40. De Las Rivas, J., et al. Cancer drug resistance induced by EMT: novel therapeutic strategies. Arch Toxicol. 95 (7), 2279-2297 (2021).
  41. Tian, S., et al. SERPINH1 regulates EMT and gastric cancer metastasis via the Wnt/β-catenin signaling pathway. Aging (Albany NY). 12 (4), 3574-3593 (2020).

Play Video

Cite This Article
Zhang, Y., Kuang, S., Qin, H., Zhao, N., Yang, Y., Xie, J. Multiomics Analysis of TMEM200A as a Pan-Cancer Biomarker. J. Vis. Exp. (199), e65795, doi:10.3791/65795 (2023).

View Video