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一种用于在人群层面估算贫血的集成决策支持工具的即时检测方法

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DOI：

10.3791/65810

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2024年1月19日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Clinical Division, ICMR-National Institute of Nutrition, 2Food and Drug Toxicology Division, ICMR-National Institute of Nutrition

本文内容

摘要

在临床现场缺乏准确的血红蛋白检测方法，这可能阻碍基于人群的贫血治疗项目。因此，我们开发了一种基于混合毛细血管血样和集成于定制软件应用程序中的全自动分析仪的现场检测方法，用于将血红蛋白值分类为不同等级的贫血。

摘要

需要可靠的床旁检测方法来评估人群水平的贫血状况。目前准确的检测方法依赖实验室设备，无法在床旁使用。为解决这一局限，本研究开发了一种基于毛细血管血混合样本和便携式自动分析仪的新方法，用于血红蛋白（Hb）浓度的测定。此外，还开发了定制软件，可将近实时获取的自动分析仪Hb检测值自动传输至服务器。同时，开发了一种决策支持工具，能够立即根据Hb值将受试者划分为不同的贫血程度等级。该决策支持工具依据世界卫生组织（WHO）关于人群水平贫血的诊断切点值设计，适用于所有年龄和性别群体。这一方法简便且用户友好，可 可由技术能力有限的一线卫生工作者轻松使用。总体而言，所开发的方法能够 可在护理现场使用且具有高准确性。这种高通量方法能够 可用于对所有年龄和性别群体进行人群水平的贫血筛查。

引言

贫血是全球主要的公共卫生问题，尤其在印度尤为严重。众所周知，贫血对人群的劳动生产率以及国家的经济增长具有不利影响1。为了加强国家层面减少贫血的努力，2018年启动的最新公共卫生项目是“无贫血印度”计划（Anemia Mukt Bharat，简称AMB）。AMB将“检测”后进行针对性“治疗”确定为降低脆弱年龄组贫血患病率最有前景的策略之一2。然而，实施AMB的“先检测后治疗”策略需要准确的现场即时检测（POC）血红蛋白（Hb）评估方法。此外，在大规模社区调查中，可靠的检测方法对于准确估计贫血患病率也十分必要。目前的POC检测方法包括无创和微创设备，通常使用毛细血管血液样本进行血红蛋白测定3。然而，多种分析前因素，如指尖采血深度和方式的差异、皮肤厚度以及POC设备在不同环境条件下的稳定性，会导致测量结果不精确，从而造成贫血患病率估计值存在较大差异3,4,5。因此，亟需建立一种适用于资源匮乏地区的血红蛋白检测方法，该方法应具备便携性、较短 周转时间（TAT）和高效性6。为满足上述需求，研究人员开发了一种毛细血管血液 pooling 采集方法：采用触控式采血针（以确保采血深度和尺寸的一致性），将6–8滴自由流出的血液收集至含乙二胺四乙酸钾（EDTA）的微量采血管中。随后，在配备不间断电源的移动车辆内或附近有电力供应的场所（如安甘瓦迪中心、卫生诊所、潘查亚特办公室或家庭），使用便携式自动分析仪对这些样本中的血红蛋白进行测定。一项验证研究将该方法与两种金标准方法（配对静脉血样本和氰化高铁血红蛋白法）进行比较，结果表明其具有高度的准确性和精密度7,8。

除了建立一种有效且可靠的即时检测（POC）方法外，还需要快速决策，以促进在人群层面开展贫血的筛查与治疗。目前，在医疗机构进行血红蛋白（Hb）检测并由医务人员直接监督铁剂和叶酸（IFA）补充剂发放的情况下，尚难以实现这一目标。由于初级卫生保健中心的医务人员需服务大量人群，导致干预措施的启动存在显著的时间延迟。因此，亟需一种能够减轻医务人员工作负担、并使一线卫生工作者能够在无需医务人员直接参与的情况下独立实施干预的技术。为此，本研究旨在开发一款定制化应用程序（eSTAR app），该程序可自动传输检测设备的数据，并内置算法，根据血红蛋白值、年龄和性别分组，为一线工作人员提供IFA补充剂剂量的决策支持。该软件采用开源工具开发，包括PHP：超文本预处理器（PHP）脚本语言、PHP Desktop Chrome，并以Visual Studio Code作为集成开发环境。基于“无贫血印度”（Anemia Mukt Bharat）指南的详细治疗方案已整合至该Android应用程序中2。

这种整合方法满足了在保持准确性和精确性的同时不断缩短检测结果周转时间的需求。此外，能够在几分钟内提供结果，有助于快速决定是否启动治疗，从而改善干预措施的实施效果9。该整合方法可适用于任何包含血红蛋白（Hb）检测的现场调查或干预项目。同时，也可在医疗机构中作为医务人员决定是否采用铁剂叶酸（IFA）治疗的工作辅助工具。

方案

该方案遵循印度海得拉巴市印度医学研究委员会-国家营养研究所机构审查委员会的指南（IRB 编号：08/I/2018）。

1. 使用血液分析仪进行血红蛋白分析的混合毛细血管样本采集10,11

  1. 配置条形码打印机和扫描仪
    1. 将条形码打印机连接到笔记本电脑系统。
    2. 在笔记本电脑上安装条形码打印机驱动程序。
    3. 在打印机属性中共享该打印机。
    4. 在应用程序中测试条形码打印，检查是否存在任何错误。
    5. 将条形码扫描仪连接至自动分析仪，它将自动完成配置。
    6. 双击图标以打开安装在台式机/笔记本电脑上的应用程序软件。在登录页面输入授权的凭据。
      注意：应用程序的主页包含用于上传实验室结果、条形码打印质量控制（QC）报告以及最终血液学报告的标签页。
    7. 要生成条形码，请点击 条形码打印 标签页。输入村庄名称等地理信息后，参与者列表将自动显示在条形码打印标签页中。
    8. 点击 显示选择，列表将出现。然后点击打印 条形码。
  2. 采集混合毛细血管血液样本（图1）
    1. 对成年患者进行毛细血管采血时，使用左手中间三根手指中的一根。
    2. 请受试者采取舒适坐姿，以便采血人员能够方便地接触其手指。
    3. 用含70%异丙醇的酒精棉片清洁手指，并使其自然干燥。
    4. 在确认受试者身份后、皮肤穿刺前，立即用与受试者相关的信息（条形码）标记微量采血管。
    5. 使用一次性安全采血针（接触激活式采血针 2.0 × 1.5 mm）采集血液样本。穿刺部位应位于手指指尖约1 cm处，介于中点与手指侧面之间。穿刺必须在中指或无名指指腹朝上的表面进行。
    6. 擦去第一滴血液，将后续血液滴入涂有涂层的微量采血管中。
    7. 切勿按摩手指。
    8. 将微量采血管垂直置于穿刺部位下方，使血滴在不施加压力的情况下自由流入管内。重复操作，直至收集4–6滴血液（约200 µL）。
    9. 仅在盖紧微量采血管盖子后，通过轻轻旋转和倒置的方式混匀管内内容物。
    10. 收集到3–4滴血液后，用棉签按压指尖，并让受试者保持静止。施加手动压力以止血。
    11. 根据生物废弃物处理指南立即处置采血针。

2. 使用血细胞分析仪进行分析

  1. 自动分析仪与软件的配置
    1. 在笔记本电脑上下载并安装 FileZilla Server 组件（127.0.0.1）。
      注意：禁用 Windows 防火墙或任何第三方防火墙。
    2. 在笔记本电脑上安装定制软件，并复制美国材料与试验协会（ASTM）文件所在路径（C/programfiles x86/destined folder/ Web/wb/astmfiles）
    3. 在 FileZilla 服务器应用程序中，创建用户和密码，并映射 astm 文件的存储位置。
    4. 在自动分析仪设备中，配置相同的IP系列（在主设置中）。
    5. 在自动分析仪中，将astm sync选项更改为FTP，并提供在笔记本电脑上配置的IP地址和凭据（例如，192.168.1.1以及配置的FileZilla用户名和密码）。
    6. 重启自动分析仪，待其就绪后测试文件同步过程。
  2. 使用自动分析仪对血液样本进行分析
    1. 使用全自动便携式血液分析仪，可在床旁检测（POC）环境中即时测量血红蛋白（Hb）及其他红细胞指数，包括平均红细胞体积（MCV）、平均红细胞血红蛋白量（MCH）、平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）和红细胞分布宽度（RDW）。
    2. 检查溶剂液位（至少为1/4）th 试剂瓶是否已填充）并确认其数量是否充足。
      注意：溶剂包括酶解液、裂解液和缓冲等渗溶液（材料表）。
    3. 通过点击开启仪器 开/关 打开仪器，确保该设备通过屏蔽双绞线（FTP）电缆与笔记本电脑连接。
    4. 检查液晶显示屏（LCD），以确认外部温度是否适合启动 是否进行分析。温度 >35 °C 不建议。将设备置于环境温度为 <35 °C
    5. 初始化完成后，让分析仪自动运行启动循环（自动启动功能默认处于激活状态）。
    6. 启动循环结束后，检查仪器显示屏上的参考空白计数。确保参考空白计数不超过以下参数限值：Hb < 0.3 g/dL 和 WBC < 0.3 × 103/mm3，红细胞 < 0.02 × 106/mm3；HCT 0% 和 PLT < 10 × 103/mm3然后，按下 √ 按钮以确认空白结果。
    7. 如果分析仪在初始化阶段完成后未自动运行启动循环，请按下 启动 按下仪器前面板上的按键以启动循环。
    8. 现在，分析仪将显示登录页面。输入预设的用户名和密码。按下 √ 继续操作的按钮。
    9. 在样本分析之前，运行三个水平的质控品（低值、正常值和高值）以检查分析仪的精密度。质控品应保存在2-8 °C环境中，使用前恢复至室温（RT）。使用前需轻轻混匀质控品数次。
      注意：对照品由生产商作为即用型试剂提供，可直接使用。试剂瓶应储存于 4 °C。通常保质期为 15 天。应定期使用Levey-Jennings质控图进行监测。若对照值超出或低于 3 SD，应使用供应商提供的清洗液进行强化清洗。
    10. 一旦质量控制步骤成功完成，即可准备进行样品分析。
    11. 扫描样品容器上的条形码，并按下连接到分析仪的扫描器上的 X 标记。
    12. 提及受试者的性别（男性或女性），然后按下 √ 继续操作的按钮。
    13. 仪器将显示受试者的详细信息及代码。按下 X 如果输入的详细信息有误。
    14. 上机前，轻轻而充分地混匀血样。
    15. 小心取下盖子，避免血液溢出。
    16. 将试管置于采样针下方，向上移动试管，直至采样针进入血液。
    17. 按压 开始 切换。采样针将吸取10 µL血液。分析周期约持续60秒。周期结束时，结果将显示在LED面板上。
    18. 点击以打印结果 打印机 图标。
    19. 单击向后箭头以继续处理第二个样本。
    20. 分析完成后，上传实验室检测结果。
  3. 将分析仪中的数据上传至服务器。
    1. 将系统连接至任何提供最低20 mbps速度的互联网服务提供商。
    2. 双击安装后出现在桌面上的应用程序图标以打开软件。在登录页面输入授权凭证。
      注意：该应用程序的主页包含用于上传实验室结果、打印条形码、质量控制报告以及最终血液学报告的标签页。实验室检测结果上传页面显示已完成的检测。文件名由仪器编号和分析日期组成，格式为 .astm。
    3. 点击 上传结果 按钮。一旦结果成功上传至服务器，.astm 文件将被转换为 .csv 格式，转换后的文件将显示在血液学报告中。请下载 .astm 格式的文件以备存档。
      注意：页面将显示弹出窗口文件已成功上传。如果存在重复文件，系统将予以识别。
    4. 对于已上传ASTM文件的参与者，其贫血状态的判定（基于 表1 和 表 2) 将在网页应用程序中生成为报告。要查看贫血的诊断结果，请登录网页应用程序，点击 报告，然后点击 EDSS报告将对所有参与者以表格形式显示。
    5. 要查看个人检测结果、贫血状态判定以及治疗方案，请登录随访应用程序，使用编号或姓名搜索受试者，然后点击 EDSS 按钮，并查看结果。

结果

验证方法的有效性
通过与静脉血自动分析仪法这一金标准进行比较，确立了该方法的有效性。验证研究的详细内容已在其他文献中描述8。简而言之，748名明显健康的志愿者在同一天内连续提供了静脉血样本和毛细血管血样本。分析在即时检测（POC）现场进行。参与者的血红蛋白（Hb）值范围广泛，涵盖无贫血、轻度、中度和重度贫血状态的不同类别。为确立该方法的有效性，计算了均值差异及其置信区间。采用Bland-Altman分析法估算了不同方法之间的一致性偏差和一致性界限。

毛细血管血液自动分析仪法与金标准静脉血自动分析仪法测得的平均血红蛋白（Hb）值之间的差异较小（表3）。两种方法比较的Bland-Altman图见图2。平均差值及一致性界限为0.1 g/dL（-1.0 至 0.8）。

两种方法对无贫血患病率的估计值相差2.2个百分点。不同贫血程度的患病率估计值也十分接近，证实了该方法相对于金标准方法的有效性（表3）。

测试集成软件与决策支持工具
该集成方法在古特凯萨尔纳拉帕利布加拜村的68名参与者中进行了试点。决策支持工具准确提供了这些参与者的贫血状况及铁叶酸（IFA）剂量，现场医务人员根据算法对结果进行了人工核验（表4）。

结果表明，这种整合的即时检测（POC）方法是有效的，可用于估计人群水平的贫血患病率。迄今为止，利用该方法已生成约16,539条针对不同贫血程度的诊断决策。

1A. 使用便携式试剂盒进行现场血糖检测，医护人员在户外环境中协助患者。 1B. 血糖检测特写，医护人员使用采血针从患者指尖采集血样。 1C. 配备现场医疗设备的移动诊断车，医疗专业人员正在查看检测结果。
图1：样本采集与自动分析仪设置。（A、B）采集混合毛细血管样本。（C）在护理现场设置自动分析仪。请点击此处查看此图的放大版本。

比较静脉血与毛细血管血自动分析仪血红蛋白水平的Bland-Altman图，统计分析。
图 2：Bland-Altman图。 该图比较了所开发方法（毛细血管血-自动分析仪法）与金标准方法（静脉血-自动分析仪法）之间的平均差异及一致性界限。两种方法之间的平均差异为-0.1（95%置信区间，-0.2；-0.1）。本图经Dasi等8许可修改。 请点击此处查看此图的放大版本。

EDSS 药物分发界面；通过彩色卡片显示剂量信息；显示受试者详细信息。
图 3：决策支持工具。 该工具显示贫血程度以及铁剂和叶酸的治疗剂量。请点击此处查看此图的放大版本。

人群临界值（g/dL）轻度和中度贫血重度贫血
6–59月龄儿童≥11.0≥7.0–<11.0<7.0
5–11岁≥11.5≥8.0–<11.5<8.0
12–19岁（女孩）≥12≥8.0–<12<8.0
12–14岁（男孩）≥12≥8.0–<12<8.0
15–19岁（男孩）≥13≥8.0–<13<8.0
男性≥13≥8.0–<13<8.0
非孕期及哺乳期女性≥12≥8.0–<12<8.0
孕妇≥11≥7.0–<11.0<7.0

表1：将参与者分为不同贫血等级的标准

人群每日剂量（治疗剂量）
6–59月龄儿童3 mg/kg 体重（含20 mg铁和100 µg叶酸的铁糖浆）
5–9岁45 mg铁 + 400 µg叶酸/日（体重低于18.5 kg时，粉色片剂）
60 mg铁 + 500 µg叶酸/日（>18.5 kg，蓝色片剂）
10–11岁120 mg铁 + 1 mg叶酸（蓝色片剂）
12–19岁（女孩）120 mg铁 + 1 mg叶酸（蓝色片剂）
12–14岁（男孩）120 mg铁 + 1 mg叶酸（蓝色片剂）
15–19岁（男孩）120 mg铁 + 1 mg叶酸（蓝色片剂）
男性120 mg铁 + 1 mg叶酸（红色片剂）
非孕期非哺乳期女性及哺乳期女性120 mg铁 + 1 mg叶酸（红色片剂）
孕妇120 mg铁 + 1 mg叶酸（红色片剂）

表2：治疗方案。 剂量应根据体重给予（如果体重低于相应年龄标准）。重度贫血参与者被转诊至当地初级卫生保健中心。对于预防性剂量，除孕妇每日服用1片铁叶酸片外，其余人员每周服用1片铁叶酸片。儿童则每两周给予1 mL。治疗持续3个月。

方法平均血红蛋白（标准差）g/dL贫血患病率（总体）(%)不同程度贫血的患病率 (%)
轻度中度重度
毛细血管血自动分析仪法11.0 (2.1) 34.919.736.49.1
静脉血自动分析仪法10.9 (2.0) 32.220.73710

表3：通过混合毛细血管血与自动分析仪法和静脉血自动分析仪法测得的血红蛋白估计值之间的比较。

年龄组N平均血红蛋白标准差集成系统生成的决策*
轻度贫血中度贫血非贫血
6–59 月龄119.71.41452
5–11 岁911.41.59225
12–14 岁412.41.56112
非孕期女性2811.71.298614
男性1614.71.340313
总计6811.981.44151736
*自动化决策已由现场医疗官核实

表4：集成系统生成的平均血红蛋白值及相应决策。

讨论

本论文介绍了一种利用混合毛细血管血液样本和自动分析仪的即时检测方法。该方法集成了定制软件，可自动将分析仪的结果上传至服务器，并生成贫血诊断决策。此外，该软件还可根据国家项目方案2提供铁叶酸（IFA）的治疗剂量建议。

定制软件旨在整合条形码打印、血液学数据导出及数据可视化功能。该软件采用基于PHP的在线桌面应用程序设计，使用PHP脚本语言和PHP Desktop Chrome，并以Visual Studio Code作为集成开发环境。用户界面使用HTML 5、CSS和JavaScript进行设计。Web服务通过PHP脚本语言开发。用户可 使用该桌面应用程序通过条形码打印机打印多个条形码。采用条形码扫描仪读取条形码数据并将其发送至自动分析仪。数据本地存储采用 SqlLite，服务器端存储采用 MySql 数据库，并以 MySql Workbench 作为操作环境。血液学报告亦可下载为 PDF 格式。基于“无贫血印度”（Anemia Mukt Bharat）指南的详细治疗方案12 已集成到 Android 应用程序中（表1 和 表2)2该模块计算了 根据参与者的年龄、性别、生理状况和血红蛋白水平确定铁酸叶酸（IFA）剂量（IFA片剂的类型和数量）。对于需要服用铁糖浆的幼儿，剂量（以毫升计）根据儿童体重计算。电子决策支持系统（EDSS）显示内容包括：（i）参与者的贫血状况（贫血分级或无贫血）；（ii）处方IFA包装的可视化展示（粉红色代表45 mg片剂，青少年用60 mg片剂为蓝色，成人用60 mg片剂为红色）；（iii）剂量（每月发放的片剂数量）；（iv）服用频率和时间（每日一次或每周一次，餐后服用）图3).

目前印度的贫血防控项目覆盖了八个不同年龄和性别的群体。治疗剂量各不相同，包含5种预防性剂量和7种治疗性剂量。由于这种复杂性，可能导致由教育水平和技能有限的一线卫生工作者在决策过程中出现错误。使用该软件可消除此类错误，使治疗实施更加快速和准确。因此，该软件有望成为一线卫生工作者在人群层面推行贫血防控项目的实用工作辅助工具。以往研究表明，一线卫生工作者能够 成功运用数字技术进行数据收集和记录管理13。获得电子化工作辅助工具还将 增强这类重要的一线社区卫生服务人员对自身职业身份的认同感14。

该方法每份样品的分析基本成本约为75印度卢比，包括 lancet、microtainer 和试剂。尽管已进行系统的成本分析 迄今为止尚未对此方法进行过相关研究，但我们认为总体成本将会 与其他常用的即时检测（PoC）方法（如数字血红蛋白仪）相当，后者每样本分析成本约为 INR 104-17715此外，考虑到自动分析仪具有诸多重要优势，其中可包括红细胞指数等指标 可获得，基于自动分析仪的方法可以 在基于人群的调查中具有良好的应用前景。

为了在野外环境中最佳地使用该集成方法，需要遵循若干关键步骤。在采集血样时，应注意不要按压手指。另一个关键步骤是样品混匀。样品采集后应立即在分析前充分混匀，以获得准确的结果。在上传样品数据期间，需要关闭笔记本电脑上安装的防火墙。该系统在使用现场借助1 KVA电池供电，可使分析仪持续运行约4小时。

该方法的一个局限性是其对温度敏感。当环境温度高于 35 °C 时，分析仪在带有空调的车辆内运行效果最佳。如果分析后的样本数据被上传两次，系统会自动显示最近一次的上传结果，尽管所有文件在后端均可用。  决策支持工具在提供决策方面具有较高准确性。但其使用要求一线卫生工作者具备一定的数字素养。由于该软件支持双语，因此一线卫生工作者理解显示语言并不困难。 然而，若需将该软件推广至特伦甘纳邦以外的地区，则需要加入新的语言支持。

借助基于算法的决策支持工具和简化的可视化输出，一线卫生工作者将能够治疗贫血患者，并在治疗期间持续进行随访。该整合方法具有可扩展的潜力，完全基于开源平台设计，且具备互操作性。这一数字工具将为在资源有限的环境中推广“筛查与治疗”干预措施以减少贫血提供有力推动。

致谢

研究团队感谢 J. Suresh 先生、Medappa 先生、Madhu 女士以及印度班加罗尔 Kavintech Corporation 全体成员，他们成功开发了决策支持工具和软件。 作者还感谢印度医学研究理事会（印度政府）为本研究提供的资金支持，以及特伦甘纳邦公共卫生与家庭福利部门对研究实施的协助。 

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ABX Miniclean 日本堀场株式会社 23-450-004酶解液
ABX Minidil LMG 日本堀场株式会社 23-450-008用于红细胞/血小板稀释、套管及清洗的缓冲等渗溶液
ABX Minilyse 日本堀场株式会社 23-450-006血红蛋白测量；裂解液
ABX Minocal日本堀场株式会社 2032002校准品
ABX Minoclair 日本堀场株式会社 23-450-003清洗试剂
ABX Minotrol 16 - 2H日本堀场有限公司 2042209血液对照
ABX Minotrol 16 - 2L日本堀场株式会社 2042208血液对照
ABX Minotrol 16 - 2N日本堀场株式会社 2042202血液对照
自动分析仪 日本堀场株式会社 ABX Micros ES 60FTP端口应处于正常工作状态
条形码打印机美国技术服务中心公司TSC Model TE 244400 MHz 32 位 RISC 处理器，配备 16 MB SDRAM 和 8 MB 闪存
条形码扫描仪RetsolLS-450任何能够提供具备以下规格扫描仪的公司：32 位 CPU，快速解码能力，IP54 等级，光源 – 650 nm 可见激光二极管，单扫描模式，扫描速率为 100 次/秒，扫描宽度为 200 mm &和4密耳的精度，扫描角度 – 偏航角 65 度，旋转角 30 度 &和 俯仰角 55 度，扫描指示 – 蜂鸣器，指示灯，扫描模式为手动 &并继续扫描
BD针头固定器Becton, Dickinson and company Ltd，爱尔兰都柏林364879
接触激活式采血针Becton, Dickinson and company Ltd，爱尔兰都柏林366594, 366593对于1岁以下的儿童，已采集静脉血样。
定制软件 Kavin Corporation，班加罗尔N/A
K2-EDTA 微量采血管-5 mLBecton, Dickinson and company Ltd，爱尔兰都柏林363706含1.0 mg K2 EDTA的EDTA管，用于血液分析，尺寸为13 × 75 mm
标签G-Technologies，塞康德拉巴德，特伦甘纳邦N/A
笔记本电脑任何N/AIntel Core I3-1005G1  8GB DDR4，1TB HDD，15.6 英寸全高清LED显示屏，Windows 11家庭版  和 MS OFFICE H&和 

参考文献

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