Summary

緑膿菌からのシデロフォア産生の定性的および定量的分析

Published: March 15, 2024
doi:

Summary

このプロトコルは緑 膿菌からの総siderophores、pyoverdineおよびpyochelinの質的な、量的な分析を提供する。

Abstract

緑膿菌 (P. aeruginosa)は、宿主に感染を確立するためにさまざまな病原性因子を産生することで知られています。そのようなメカニズムの1つは、シデロフォア生成による鉄の掃気です。 緑膿菌は 、鉄キレート親和性が低いピオケリンと、鉄キレート親和性が高いピオベルジンの2種類のシデロフォアを産生します。この報告は、ピオベルジンは細菌の上清から直接定量できるのに対し、ピオケリンは定量前に上清から抽出する必要があることを示しています。

シデロフォアの産生を定性的に分析するための主要な方法は、クロムアズロールスルホン酸(CAS)寒天プレートアッセイです。このアッセイでは、Fe3+-色素錯体からCAS色素が放出されると、青色からオレンジ色に色が変化し、シデロフォアの生成が示されます。総シデロフォアの定量のために、細菌上清をマイクロタイタープレートでCAS色素と等の割合で混合し、続いて630 nmで分光光度分析を行いました。ピオベルジンは、細菌上清を 50 mM Tris-HCl と等量ずつ混合し、分光光度分析を行うことにより、直接定量しました。380 nmのピークにより、ピオベルジンの存在が確認されました。ピオシュリンについては、細菌の上清から直接定量することができなかったため、最初に抽出する必要がありました。その後の分光光度分析により、313 nmにピークを持つピケリンの存在が明らかになりました。

Introduction

生物は、電子輸送やDNA複製など、さまざまな重要な機能を果たすために鉄を必要とします1緑膿菌はグラム陰性日和見病原体であり、宿主に感染を確立する様々な病原性因子を有することが知られており、そのメカニズムの1つがシデロフォア形成である2。鉄が枯渇すると、 緑膿菌 はシデロフォアと呼ばれる特殊な分子を放出し、周囲の環境から鉄を消光します。シデロフォアは細胞外に鉄をキレート化し、得られた鉄−シデロフォア複合体は細胞3に積極的に輸送される。

緑膿菌は、ピオベルジンとピオケリンの2つのシデロフォアを産生することが知られています。ピオベルジンは鉄キレート親和性が高い(1:1)のに対し、ピオケリンは鉄キレート親和性が低い(2:1)ことが知られています4。ピョーシュリンは、鉄キレート親和性が低いため、二次シデロフォアとも呼ばれます5。シデロフォアの産生と調節は、緑膿菌6のクォーラムセンシング(QS)システムによって能動的に制御されています。

鉄の消光に加えて、シデロフォアは病原性因子の調節にも関与し、バイオフィルム形成に積極的な役割を果たします7。シデロフォアは、細胞シグナル伝達への関与、酸化ストレスに対する防御、微生物群集間の相互作用の促進など、さらに重要な役割を果たします8。シデロフォアは、通常、鉄をキレート化する特定の官能基に基づいて分類されます。この分類における3つの主要な二座配位子は、カテコール酸、ヒドロキサメート、およびα-ヒドロキシカルボン酸3です。ピオベルジンは、緑膿菌蛍光蛍光菌などの蛍光シュードモナス種の特徴です5。それらは、6〜12個のアミノ酸を含むオリゴペプチドに結合した混合緑色蛍光発色団で構成されています。いくつかの非リボソームペプチド合成酵素(NRP)がそれらの合成に関与している9。ピオベルジンの産生と調節に関与する4つの遺伝子は、pvdL、pvdI、pvdJ、およびpvdD10です。ピオベルジンは、哺乳類の感染と病原性にも関与しています11緑膿菌は中程度の鉄制限条件下でピオケリンを産生することが知られており、ピオベルジンは厳しい鉄制限環境で産生される12。ピケリン産生に関与する2つのオペロンは、pchDCBAとpchEFGHI13です。ピオシアニンの存在下では、ピオケリン(カテコール酸)が酸化的損傷および炎症を誘発し、宿主組織に有害なヒドロキシルラジカルを生成することが注目される11

クロムアズロールスルホン酸(CAS)アッセイは、感度はあるものの特異性が高すぎる可能性のある微生物学的アッセイと比較して、その包括性、高感度、および利便性のために広く採用されています14。CASアッセイは、寒天表面または溶液中で実施できます。これは、第二鉄イオンが強い青色の錯体からオレンジ色に遷移するときに発生する色の変化に依存しています。CAS比色アッセイは、Fe-CAS界面活性剤の三元錯体からの鉄の枯渇を定量化します。金属、有機染料、界面活性剤からなるこの特定の錯体は青色をしており、630 nmで吸収ピークを示します。

本報告では、寒天プレート上のシデロフォアの産生を検出できるシデロフォア産生の定性検出法について紹介する。また、緑 膿菌由来の2つのシデロフォア(ピオベルジンおよびピオケリン)の検出および定量分析を行うマイクロタイタープレートにおける総シデロフォア産生量の定量的推定方法も提供される。

Protocol

緑膿菌のすべての分離細菌は、インドのバドーダラとジャイプールの医療微生物学研究所から入手しました。選択されたすべての臨床分離株はバイオセーフティキャビネット(BSL2)で取り扱われ、実験中の細菌分離株の取り扱いには細心の注意が払われました。すべての試薬/溶液の商品詳細は、材料表に記載されています。 1. クロムアズロールスルホン?…

Representative Results

臨床分離株からのシデロフォアの定量化の前に、シデロフォア産生の定性スクリーニングを実施して、シデロフォア産生を確実にしました。臨床分離株からのシデロフォアの定性的検出は、CAS寒天プレート上のストリーキング細菌によって観察されました。MR1、TL7、J3、およびPAO1(参照株)の3つの臨床分離株が研究のために選択されました。3つの臨床分離株とPAO1はす?…

Discussion

このプロトコルにより、研究者は、細菌の無細胞上清から緑膿菌の総シデロフォアと2つの異なるシデロフォア、すなわちピオベルジンとピオケリンを定量化することができます。CAS寒天プレートアッセイでは、CAS色素とFe3+イオンが複合体を形成します。バクテリアがシデロフォアを生成すると、CAS-Fe3+複合体からFe3+イオンを消光し、バクテリアの増殖周囲に?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者は、DBT(バイオテクノロジー教育プログラム)、DBT(BUILDERプログラム)、およびFISTからの資金提供を認めています。SHODHから受けたフェローシップに感謝します。CSIRから受けたフェローシップに感謝します。

Materials

Agar Agar, Type I HIMEDIA GRM666
8-Hydroxyquinoline Loba Chemie 4151
Casamino Acid SRL Chemicals 68806
Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB) HIMEDIA RM4867-100G
Chloroform Merck 1070242521
Chrome azurol sulfonate HIMEDIA RM336-10G
Citric acid Merck 100241
Dextrose monohydrate Merck 108342
Dichloromethane Merck 107020
Ferric chloride hexahydrate HIMEDIA GRM6353
Glass Flasks Borosil 5100021
Glass Test-tubes Borosil 9820U05
Hydrochloric acid SDFCL 20125
King's medium B base HIMEDIA M1544-500G
M9 Minimal Medium Salts HIMEDIA G013-500G
Magnesium Sulphate  Qualigens 10034
MultiskanGO UV Spectrophotometer Thermo Scientific 51119200
Peptone Type I, Bacteriological HIMEDIA RM667-500G
PIPES free acid MP Biomedicals 190257
Potassium dihydrogen phosphate Merck 1048731000
Proteose peptone HIMEDIA RM005-500G
Shimadzu UV-Vis Spectrophotometer Shimadzu 2072310058
Sigma Laborzentrifuge Sigma-Aldrich 3-18K
Sodium chloride Qualigens 15915

References

  1. Wang, J., Pontopolous, K. Regulation of iron cellulatar metabolism. Biochemical Journal. 434 (3), 365-381 (2011).
  2. Schalk, I., Perraud, Q. Pseudomonas aeruginosa and its multiple strategies to access iron. Environmental Microbiology. 25 (4), 811-831 (2022).
  3. Ghssein, G., Ezzeddine, Z. A review of Pseudomonas aeruginosa metallophores: Pyoverdine, pyochelin and pseudopaline. 生物学. 11 (12), 1711 (2022).
  4. Sanchez-Jimenez, A., Marcos-Torres, F. J., Llamas, M. A. Mechanisms of iron homeostasis in pseudomonas aeruginosa and emerging therapeutics directed to disrupt this vital process. Microbial Biotechnology. 16 (7), 1475-1491 (2023).
  5. Cornelis, P., Dingemans, J. Pseudomonas aeruginosa adapts its iron uptake strategies in function of the type of infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4 (11), (2013).
  6. Lin, J., Cheng, J., Shen, X. The pseudomonas quinolone signal (pqs): Not just for quorum sensing anymore. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8 (7), 1-9 (2018).
  7. Sass, G., et al. Intermicrobial interaction: Aspergillus fumigatus siderophores protect against competition by pseudomonas aeruginosa. PLoS ONE. 14 (5), 1-19 (2019).
  8. Dao, K. -. H. T., Hamer, K. E., Clark, C. L., Harshman, L. G. Pyoverdine production by pseudomonas aeruginosa exposed to metals or an oxidative stress agent. Ecological Applications. 9 (2), 441-448 (1999).
  9. Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. Pyoverdine siderophores: From biogenesis to biosignificance. Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).
  10. Ackerley, D. F., Caradoc-Davies, T. T., Lamont, I. L. Substrate specificity of the nonribosomal peptide synthetase pvdd from pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 185 (9), 2848-2855 (2003).
  11. Geum-Jae-Jeong, , et al. Pseudomonas aeruginosa virulence attenuation by inhibiting siderophore functions. Applied Microbiology and Biotechnology. 107 (4), 1019-1038 (2023).
  12. Dumas, Z., Ross-Gillespie, A., Kummerli, R. Switching between apparently redundant iron-uptake mechanisms benefits bacteria in changeable environments. Biological Sciences. 280 (1764), 20131055 (2013).
  13. Gaille, C., Reimmann, C., Haas, D. Isochorismate synthase (pcha), the first and rate-limiting enzyme in salicylate biosynthesis of pseudomonas aeruginosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 16893-16898 (2003).
  14. Schwyn, B., Neilands, J. B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).
  15. Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. Use of blue agar cas assay for siderophore detection. Journal of Microbiology & Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).
  16. Arora, N. K., Verma, M. Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria. 3 Biotech. 7 (381), 1-9 (2017).
  17. Frac, M., Gryta, A., Oszust, K., Kotowicz, N. Fast and accurate microplate method (biolog mt2) for detection of fusarium fungicides resistance/sensitivity. Frontiers in Microbiology. 7 (4), 1-16 (2016).
  18. Cezard, C., Farvacques, N., Sonnet, P. Chemistry and biology of pyoverdines, pseudomonas primary siderophores. Current Medicinal Chemistry. 22 (2), 165-186 (2015).
  19. Braud, A., Hoegy, F., Jezequel, K., Lebeau, T., Schalk, I. J. New insights into the metal specificity of the pseudomonas aeruginosa pyoverdine-iron uptake pathway. Environmental Microbiology. 11 (5), 1079-1091 (2009).
  20. Brandel, J., et al. a siderophore of pseudomonas aeruginosa: Physicochemical characterization of the iron(iii), copper (ii) and zinc (ii) complexes. Dalton Transactions. 41 (9), 2820-2834 (2012).
  21. Hoegy, F., Mislin, G. L. A., Schalk, I. J. Pseudomonas methods and protocols. Methods in Molecular Biology. 1149, (2014).
  22. Cunrath, O., et al. The pathogen pseudomonas aeruginosa optimizes the production of the siderophore pyochelin upon environmental challenges. Metallomics. 12 (12), 2108-2120 (2020).
  23. Ji, A. J., et al. A novel and sensitive LC/MS/MS method for quantification of pyochelin in human sputum samples from cystic fibrosis patients. Biomarkers & Applications. 4 (1), 135 (2019).
  24. Visaggio, D., et al. A highly sensitive luminescent biosensor for the microvolumetric detection of the pseudomonas aeruginosa siderophore pyochelin. ACS Sensors. 6 (9), 3273-3283 (2021).
  25. Miethke, M., Marahiel, M. A. Siderophore-bases iron acquisition and pathogen control. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 71 (3), 443-451 (2007).
  26. Il, J. M. R., Lin, Y. -. M., Lu, Y., Miller, M. J. Studies and syntheses of siderophores, microbial iron chelators, and analogs as potential drug delivery agents. Current Medicinal Chemistry. 7 (2), 159-197 (2000).
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Rathod, M., Patel, H., Gajjar, D. Qualitative and Quantitative Analysis of Siderophore Production from Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (205), e65980, doi:10.3791/65980 (2024).

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