녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 Siderophore 생산에 대한 정성적 및 정량적 분석
Summary
이 프로토콜은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 총 siderophores, pyoverdine 및 pyochelin에 대한 정성적 및 정량적 분석을 모두 제공합니다.
Abstract
녹농균(Pseudomonas aeruginosa , P. aeruginosa)은 숙주에 감염을 일으키기 위해 다양한 독성 인자를 생성하는 것으로 알려져 있습니다. 그러한 메커니즘 중 하나는 siderophore 생산을 통한 철의 청소입니다. 녹농균(P. aeruginosa)은 철분 킬레이트 친화도가 낮은 피오쉐린(pyochelin)과 철 킬레이트 친화도가 높은 피오베르딘(pyoverdine)의 두 가지 다른 siderophores를 생성합니다. 이 보고서는 피오베르딘은 박테리아 상층액에서 직접 정량화할 수 있는 반면, 피오쉐린은 정량화 전에 상층액에서 추출해야 함을 보여줍니다.
사이드로포어 생산을 정성적으로 분석하기 위한 기본 방법은 CAS(Chrome Azurol Sulfonate) 한천 플레이트 분석입니다. 이 분석에서 Fe3+-Dye 복합체에서 CAS 염료가 방출되면 파란색에서 주황색으로 색상이 변경되어 siderophore 생성을 나타냅니다. 총 siderophore의 정량화를 위해 박테리아 상층액을 마이크로타이터 플레이트에서 CAS 염료와 동일한 비율로 혼합한 후 630nm에서 분광광도계 분석을 수행했습니다. Pyoverdine은 50mM Tris-HCl과 동일한 비율로 혼합하여 박테리아 상청액에서 직접 정량화 한 후 분광 광도 분석을 수행했습니다. 380nm에서의 피크는 pyoverdine의 존재를 확인했습니다. Pyochelin의 경우 박테리아 상청액에서 직접 정량화할 수 없었기 때문에 먼저 추출해야 했습니다. 후속 분광 광도계 분석은 313nm에서 피크를 가진 pyochelin의 존재를 밝혀 냈습니다.
Introduction
유기체는 전자 수송 및 DNA 복제와 같은 다양한 필수 기능을 수행하기 위해 철분을 필요로 합니다1. 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)은 그람 음성 기회 병원체로, 숙주에 감염을 일으키는 다양한 독성 인자를 가지고 있는 것으로 알려져 있으며, 그 중 한 가지 기전이 사이드로포어 형성(siderophore formation)이다2. 녹농균(P. aeruginosa )은 철분이 고갈되는 동안 시데로포어(siderophores)라고 하는 특수 분자를 방출하여 주변 환경으로부터 철분을 흡수합니다. 시데로포어는 철을 세포 외에서 킬레이트화하고, 생성된 철-시데로포어 복합체는 세포로 활발하게 다시 운반된다3.
녹농균(P. aeruginosa )은 피오베르딘(pyoverdine)과 피오슐린(pyochelin)이라는 두 개의 사이드로포어(siderophores)를 생성하는 것으로 알려져 있습니다. 피오베르딘은 철분 킬레이트 친화도가 더 높은 것으로 알려져 있는 반면(1:1), 파이오쉐린은 철분 킬레이트 친화도가 더 낮은 것으로 알려져 있습니다(2:1)4. Pyochelin은 철분 킬레이트 친화도가 낮기 때문에 2차 사이드로포어(siderophore)라고도 불린다5. siderophore의 생산 및 조절은 녹농균6의 QS(Quorum Sensing) 시스템에 의해 능동적으로 제어됩니다.
철 담금질 외에도 siderophore는 독성 인자를 조절하는 데 관여하며 생물막 형성에 적극적인 역할을 합니다7. Siderophores는 세포 신호 전달에 관여하고, 산화 스트레스에 대한 방어, 미생물 군집 간의 상호 작용 촉진 등 추가로 중요한 역할을 합니다8. Siderophores는 일반적으로 철을 킬레이트화하는 특정 작용기에 따라 분류됩니다. 이 분류에서 세 가지 주요 bidentate 리간드는 catecholate, hydroxamate 및 α-hydroxycarboxylate3입니다. Pyoverdines는 녹농균(P. aeruginosa) 및 P. 형광(P. fluorescens)과 같은 형광 슈도모나스(Pseudomonas) 종의 특징이다 5. 이들은 6-12개의 아미노산을 함유하는 올리고펩타이드에 결합된 혼합된 녹색 형광 발색단으로 구성됩니다. 여러 가지 비리보솜 펩타이드 합성효소(NRP)가 합성에 관여한다9. 피오버다인 생산 및 조절에 관여하는 4가지 유전자는 pvdL, pvdI, pvdJ 및 pvdD10입니다. 피오베르딘은 또한 포유류의 감염과 독성을 담당한다11. 녹농균(P. aeruginosa)은 적당한 철분 제한 조건에서 피오슐린을 생성하는 것으로 알려져 있으며, 피오베르딘은 철분 제한 환경이 심한 환경에서 생성된다12. 피오쉐린 생산에 관여하는 두 개의 오페론은 pchDCBA와 pchEFGHI13입니다. 피오시아닌이 존재할 때, 피오첼린(카테콜레이트)은 산화적 손상과 염증을 유발하고 숙주 조직에 해로운 하이드록실 라디칼을 생성한다는 것이 주목된다11.
Chrome Azurol Sulfonate(CAS) 분석은 민감하지만 지나치게 특이적일 수 있는 미생물 분석에 비해 포괄성, 고감도 및 더 큰 편의성으로 인해 널리 채택되고 있습니다14. CAS 분석은 한천 표면 또는 용액에서 수행할 수 있습니다. 그것은 철 이온이 강렬한 파란색 복합체에서 주황색으로 전이될 때 발생하는 색상 변화에 의존합니다. CAS 비색 분석은 Fe-CAS-계면활성제 삼원 복합체에서 철의 고갈을 정량화합니다. 금속, 유기 염료 및 계면활성제로 구성된 이 특정 복합체는 파란색을 띠며 630nm에서 흡수 피크를 나타냅니다.
이 보고서는 한천 플레이트에서 시데로포어 생산을 감지할 수 있는 시데로포어 생산의 정성적 검출 방법을 제시합니다. 마이크로타이터 플레이트에서 총 사이드로포어 생산의 정량적 추정 방법과 녹농균(P. aeruginosa)의 두 가지 사이드로포어(pyoverdine)와 피오쉐린(pyochelin)의 검출 및 정량 분석도 제공됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜을 통해 연구자들은 박테리아 cell-free 상층액에서 총 siderophore와 P. aeruginosa의 두 가지 다른 siderophore, 즉 pyoverdine 및 pyochelin을 정량할 수 있습니다. CAS 한천 플레이트 분석에서 CAS 염료와 Fe3+ 이온은 복합체를 형성합니다. 박테리아가 siderophore를 생성할 때 CAS-Fe3+ 복합체에서 Fe3+ 이온을 소멸시켜 박테리아 성장 주변의 색상 변화를 유도합니다. 이 변화는 박…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 DBT – Biotechnology Teaching Program, DBT – BUILDER Program 및 FIST의 자금 지원을 인정합니다. SHODH에서 받은 MR 감사 펠로우십. HP는 CSIR로부터 받은 펠로우십에 감사를 표합니다.
Materials
| Agar Agar, Type I | HIMEDIA | GRM666 | |
| 8-Hydroxyquinoline | Loba Chemie | 4151 | |
| Casamino Acid | SRL Chemicals | 68806 | |
| Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB) | HIMEDIA | RM4867-100G | |
| Chloroform | Merck | 1070242521 | |
| Chrome azurol sulfonate | HIMEDIA | RM336-10G | |
| Citric acid | Merck | 100241 | |
| Dextrose monohydrate | Merck | 108342 | |
| Dichloromethane | Merck | 107020 | |
| Ferric chloride hexahydrate | HIMEDIA | GRM6353 | |
| Glass Flasks | Borosil | 5100021 | |
| Glass Test-tubes | Borosil | 9820U05 | |
| Hydrochloric acid | SDFCL | 20125 | |
| King's medium B base | HIMEDIA | M1544-500G | |
| M9 Minimal Medium Salts | HIMEDIA | G013-500G | |
| Magnesium Sulphate | Qualigens | 10034 | |
| MultiskanGO UV Spectrophotometer | Thermo Scientific | 51119200 | |
| Peptone Type I, Bacteriological | HIMEDIA | RM667-500G | |
| PIPES free acid | MP Biomedicals | 190257 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1048731000 | |
| Proteose peptone | HIMEDIA | RM005-500G | |
| Shimadzu UV-Vis Spectrophotometer | Shimadzu | 2072310058 | |
| Sigma Laborzentrifuge | Sigma-Aldrich | 3-18K | |
| Sodium chloride | Qualigens | 15915 |
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