Summary

Differentiatie van afstammingslijnen van het enterische zenuwstelsel van menselijke pluripotente stamcellen

Published: May 17, 2024
doi:

Summary

Het afleiden van afstammingslijnen van het enterische zenuwstelsel (ENS) uit menselijke pluripotente stamcellen (hPSC) biedt een schaalbare bron van cellen om de ontwikkeling en ziekte van ENS te bestuderen en om te gebruiken in regeneratieve geneeskunde. Hier wordt een gedetailleerd in vitro protocol gepresenteerd om enterische neuronen af te leiden uit hPSC’s met behulp van chemisch gedefinieerde kweekomstandigheden.

Abstract

Het menselijk enterisch zenuwstelsel, ENS, is een groot netwerk van glia- en neuronale celtypen met een opmerkelijke diversiteit aan neurotransmitters. Het ENS regelt de darmmotiliteit, enzymsecretie en opname van voedingsstoffen en interageert met het immuunsysteem en het darmmicrobioom. Bijgevolg zijn ontwikkelings- en verworven defecten van het ENS verantwoordelijk voor veel ziekten bij de mens en kunnen ze bijdragen aan de symptomen van de ziekte van Parkinson. Beperkingen in diermodelsystemen en toegang tot primair weefsel vormen aanzienlijke experimentele uitdagingen bij studies van het menselijke ENS. Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor effectieve in vitro afleiding van de ENS-lijnen uit menselijke pluripotente stamcellen, hPSC, met behulp van gedefinieerde kweekomstandigheden. Ons protocol begint met gerichte differentiatie van hPSC’s naar enterische neurale topcellen binnen 15 dagen en levert binnen 30 dagen diverse subtypes van functionele enterische neuronen op. Dit platform biedt een schaalbare bron voor ontwikkelingsstudies, ziektemodellering, het ontdekken van geneesmiddelen en regeneratieve toepassingen.

Introduction

Het enterische zenuwstelsel (ENS) is het grootste onderdeel van het perifere zenuwstelsel. Het ENS bevat meer dan 400 miljoen neuronen die zich in het maagdarmkanaal bevinden en bijna alle functies van de darm controleren. Moleculair begrip van de ontwikkeling en functie van het ENS en de defecten ervan bij enterische neuropathieën vereist toegang tot een betrouwbare en authentieke bron van enterische neuronen. De toegang tot menselijk primair weefsel is beperkt en diermodellen slagen er niet in om de belangrijkste ziektefenotypes in veel enterische neuropathieën te recapituleren. Menselijke pluripotente stamceltechnologie (hPSC) is buitengewoon nuttig gebleken bij het bieden van een onbeperkte bron van gewenste celtypen, vooral die welke moeilijk te isoleren zijn van primaire bronnen 2,3,4,5,6,7. Hier geven we details over een stapsgewijze en robuuste in vitro methode om ENS-culturen uit hPSC’s te verkrijgen. Deze schaalbare hPSC-afgeleide culturen openen wegen voor ontwikkelingsstudies, ziektemodellering en high-throughput medicijnscreening en kunnen transplanteerbare cellen leveren voor regeneratieve geneeskunde.

Enterische neuronlijnen zijn afgeleid van neurale topcellen (NC) die het ENS-ontwikkelingspad volgen tijdens de embryogenese. In embryo’s verschijnen NC-cellen langs de randen van de vouwende neurale plaat. Ze vermenigvuldigen, migreren en geven aanleiding tot veel verschillende celtypen, waaronder sensorische neuronen, Schwann-cellen, melanocyten, craniofaciale skelet- en darmneuronen en glia 8,9,10. De beslissing over het lot van de cel hangt af van het specifieke gebied langs de voorste-achterste as waaruit de NC-cellen tevoorschijn komen, d.w.z. craniale NC, vagale NC, romp NC en sacrale NC. Het ENS ontwikkelt zich uit vagale en sacrale NC-cellen, waarbij de eerste de populatie van de darmneuronen domineert als gevolg van de uitgebreide migratie langs de lengte van de darm en het koloniseren van de darm11.

Afleiding van NC-cellen uit PSC’s omvat gewoonlijk een combinatie van dubbele SMAD-remming en activering van de WNT-route12,13. Tot voor kort betroffen alle NC-inductieprotocollen serum- en andere additieven van dierlijke producten in de kweekomstandigheden. Chemisch ongedefinieerde media verlagen niet alleen de reproduceerbaarheid van NC-inductie, maar dagen ook mechanistische ontwikkelingsstudies uit. Om deze uitdagingen het hoofd te bieden, ontwikkelden Barber et al14 een NC-inductieprotocol met behulp van chemisch gedefinieerde kweekomstandigheden en was daarom voordelig ten opzichte van alternatieve methoden die afhankelijk zijn van serumvervangende factoren (bijv. KSR)13,14. Dit werd verkregen door basale mediavervangingen en het optimaliseren van een protocol dat oorspronkelijk werd gepresenteerd door Fattahi et al. om enterische NC-cellen af te leiden uit hPSC’s. Dit verbeterde systeem is de basis van het hPSC-differentiatieprotocol dat hier wordt gepresenteerd. Het begint met inductie van enterische neurale crest (ENC)-cellen in een periode van 15 dagen door nauwkeurige modulatie van BMP-, FGF-, WNT- en TGFβ-signalering naast retinoïnezuur (RA). Vervolgens leiden we de ENS-lijnen af door cellen te behandelen met gliacellijn-afgeleide neurotrofe factor (GDNF). Alle mediasamenstellingen zijn chemisch gedefinieerd en leveren binnen 30-40 dagen robuuste enterische neuronale culturen op.

Naast het hier beschreven monolayer celkweeksysteem zijn er alternatieve NC-inductiebenaderingen ontwikkeld die gebruik maken van vrij zwevende embryoïde lichamen 15,16. Van migrerende cellen in deze culturen is aangetoond dat ze NC-markers tot expressie brengen met een subset die de vagale NC vertegenwoordigt. Co-culturen met primair darmweefsel zijn gebruikt om enterische NC-voorlopers in deze culturen te verrijken. Mediasamenstellingen in deze onderzoeken bevatten een combinatie van verschillende factoren, zoals zenuwgroeifactor, NT3 en van de hersenen afgeleide neurotrofe factor. In dit stadium is het niet volledig duidelijk hoe deze factoren de bindingsidentiteiten van de voorlopers van enterische neuronen kunnen beïnvloeden. Voor een efficiënte vergelijking van de enterische NC-inductie in de monolaag en de embryoïde-lichaam-gebaseerde culturen zijn meer gegevens nodig. Gezien de verschillende cultuurlay-outs in deze strategieën, moet het gebruik van elke methode worden overwogen en geoptimaliseerd op basis van de specifieke toepassing in gedachten.

Het hier gepresenteerde protocol is reproduceerbaar en is door ons en anderen met succes getest met behulp van verschillende hPSC-lijnen (geïnduceerd en embryonaal) 8,14,16.

Protocol

1. Voorbereiding van de media OPMERKING: De concentraties die in het hele protocol worden genoemd, zijn de eindconcentraties van de mediacomponenten. Bereid alle media onder steriele omstandigheden voor in een laminaire vloeikap en bewaar ze bij 4 °C in het donker. Gebruik binnen 2 weken. hPSC-onderhoudsmedium: Meng het voedingsvrije hPSC-onderhoudsmediumsupplement (20 μL/ml) met het basismedium. Medium A: Voeg botmorfogenetisch eiwit 4 (BMP4; 1 ng/ml), S…

Representative Results

Dit protocol biedt een methode om enterische neurale kam en enterische neuronen af te leiden uit hPSC’s met behulp van chemisch gedefinieerde kweekomstandigheden (Figuur 1A-B). Het genereren van neuronen van hoge kwaliteit is afhankelijk van een efficiënte inductiestap voor de enterische neurale top. Dit kan visueel worden beoordeeld door de morfologie van de vrij zwevende bollen te controleren die er rond uit moeten zien met gladde oppervlakken met een grootte van ongeveer…

Discussion

Het hier beschreven differentiatieprotocol biedt een robuuste in vitro methode om binnen 30-40 dagen enterische neuronen uit hPSC’s te verkrijgen (Figuur 1E) en enterische glia die gliaal fibrillair zuur eiwit, GFAP en SOX10 tot expressie brengen in oudere culturen (> dag 55)13,14,19,22. Deze neuronen en glia worden geïnduceerd door stapsgewijze different…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Het werk werd ondersteund door subsidies van het UCSF-programma voor doorbraakbiomedisch onderzoek en de Sandler Foundation, March of Dimes-subsidie nr. 1-FY18-394 en 1DP2NS116769-01, de NIH Director’s New Innovator Award (DP2NS116769) aan F.F. en het National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R01DK121169) aan F.F., HM wordt ondersteund door Larry L. Hillblom Foundation postdoctorale fellowship, NIH T32-DK007418 fellowship en UCSF-programma voor Breakthrough Biomedical Research onafhankelijke postdoctorale fellowship.

Materials

Ascorbic acid Sigma-Aldrich A5960
B27 supplement (serum free, minus vitamin A) Gibco 12587-010
Basement membrane matrix, Geltrex Gibco A14133-2
BMP4 R&D systems 314-BP
Cell culture centrifuge Eppendorf, model no. 5810R 02262501
Cell detachment solution, Accutase Stemcell Technologies 07920
CHIR99021 Tocris 4423
Conical tubes USA scientific 1475-0511, 1500-1211
Differentiation base medium, Essential 6 Life Technologies A1516401
DMEM/F-12 no glutamine Life Technologies 21331020
EDTA Corning MT-46034CI
Feeder-free hPSC maintenance medium, Essential 8 Flex Medium Kit Life Technologies A2858501
FGF2 R&D systems 233-FB/CF
Fibronectin Corning 356008
GDNF Peprotech 450-10
Hemocytometer Hausser Scientific 1475
Human pluripotent stem cells, H9 ESC WiCell RRID: CVCL_1240
Incubator with controlled humidity, temperature and CO2 Thermo Fisher Scientific Herralcell 150i
Inverted microscope Thermo Fisher Scientific EVOS FL
Laminar flow hood Thermo Fisher Scientific 1300 series class II, type A2
Laminin Cultrex 3400-010
L-glutamine supplement, Glutagro Corning 25-015-CI
MEM NEAAs Corning 25-025-CI
Multiwell plates, Falcon BD 353934, 353075
N-2 Supplement CTS A1370701
Neurobasal Medium Life Technologies 21103049
PBS (Ca and Mg free) Life Technologies 10010023
Pipette filler Eppendorf Z768715-1EA
Pipette tips USA scientific 1111-2830
Pipettes Fisherbrand 13-678-11E, 13-678-11F
PO Sigma-Aldrich P3655
polymer coverslip bottom imaging plates, ibidi ibidi 81156
RA Sigma-Aldrich R2625
SB431542 R&D systems 1614
Trypan blue stain, 0.4% Thermo Fisher Scientific 15250-061
Ultra-low attachment plates Fisher Scientific 07-200-601
Y-27632 dihydrochloride R&D systems 1254

References

  1. Gershon, M. D. The enteric nervous system: a second brain. Hosp Pract. 34 (7), 35-38 (1999).
  2. Haggarty, S. J., Silva, M. C., Cross, A., Brandon, N. J., Perlis, R. H. Advancing drug discovery for neuropsychiatric disorders using patient-specific stem cell models. Mol Cell Neurosci. 73, 104-115 (2016).
  3. Bose, A., Petsko, G. A., Studer, L. Induced pluripotent stem cells: a tool for modeling Parkinson’s disease. Trends Neurosci. 45 (8), 608-620 (2022).
  4. Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Dev Camb Engl. 145 (5), (2018).
  5. Marchetto, M. C. N., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
  6. Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
  7. Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).
  8. Shyamala, K., Yanduri, S., Girish, H. C., Murgod, S. Neural crest: The fourth germ layer. J Oral Maxillofac Pathol. 19 (2), 221-229 (2015).
  9. Crane, J. F., Trainor, P. A. Neural crest stem and progenitor cells. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 267-286 (2006).
  10. Thomas, S., et al. Human neural crest cells display molecular and phenotypic hallmarks of stem cells. Hum Mol Genet. 17 (21), 3411-3425 (2008).
  11. Heanue, T. A., Pachnis, V. Enteric nervous system development and Hirschsprung’s disease: advances in genetic and stem cell studies. Nat Rev Neurosci. 8, 466-479 (2007).
  12. Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell Rep. 3 (4), 1140-1152 (2013).
  13. Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).
  14. Barber, K., Studer, L., Fattahi, F. Derivation of enteric neuron lineages from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 14 (4), 1261-1279 (2019).
  15. Li, W., et al. Characterization and transplantation of enteric neural crest cells from human induced pluripotent stem cells. Mol Psychiatry. 23 (3), 499-508 (2018).
  16. Workman, M. J., et al. Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system. Nat Med. 23, 49-59 (2017).
  17. Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nat Genet. 18 (1), 60-64 (1998).
  18. Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (12), 1468-1475 (2007).
  19. Majd, H., et al. hPSC-derived enteric ganglioids model human ENS development and function. BioRxiv. , (2022).
  20. Majd, H., et al. Deriving Schwann cells from hPSCs enables disease modeling and drug discovery for diabetic peripheral neuropathy. Cell Stem Cell. 30 (5), 632-647 (2023).
  21. Samuel, R. M., et al. Generation of Schwann cell derived melanocytes from hPSCs identifies pro-metastatic factors in melanoma. BioRxiv. , (2023).
  22. Richter, M. N., et al. Inhibition of muscarinic receptor signaling protects human enteric inhibitory neurons against platin chemotherapy toxicity. BioRxiv. , (2023).

Play Video

Cite This Article
Majd, H., Richter, M. N., Samuel, R. M., Kalantari, A., Ramirez, J. T., Fattahi, F. Differentiation of Enteric Nervous System Lineages from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (207), e66133, doi:10.3791/66133 (2024).

View Video