Summary

تقدير الحساسية التركيبية للمناطق المضطربة جوهريا استجابة للإجهاد المفرط الأسموزي في الخلايا الحية باستخدام FRET

Published: January 12, 2024
doi:

Summary

المناطق المضطربة جوهريا (IDRs) هي مجالات بروتينية مرنة تعدل شكلها استجابة للتغيرات البيئية. يمكن ل Ensemble fluorescence resonation Transfer Energy (FRET) تقدير أبعاد البروتين في ظل ظروف مختلفة. نقدم نهج FRET لتقييم الحساسية الهيكلية IDR في خلايا Saccharomyces cerevisiae الحية تحت ضغط فرط التناضح.

Abstract

المناطق المضطربة جوهريا (IDRs) هي مجالات بروتينية تشارك في العمليات الخلوية الحاسمة. أثناء ظروف الإجهاد ، تتغير الخصائص الفيزيائية والكيميائية للبيئة الخلوية ، مما يؤثر بشكل مباشر على المجموعة التوافقية من IDRs. IDRs حساسة بطبيعتها للاضطرابات البيئية. تعد دراسة كيفية تنظيم الخصائص الفيزيائية والكيميائية للخلية للمجموعة التوافقية من IDRs أمرا ضروريا لفهم التحكم البيئي في وظيفتها. هنا ، نصف طريقة خطوة بخطوة لقياس الحساسية الهيكلية ل IDRs في خلايا Saccharomyces cerevisiae الحية استجابة لظروف الإجهاد المفرط الأسموزي. نقدم استخدام نقل طاقة الرنين الفلوري الجماعي (FRET) لتقدير كيفية تغير الأبعاد العالمية ل IDRs أثناء الزيادة التدريجية للإجهاد المفرط الأسموزي المفروض على الخلايا التي تحتوي على أي تناضح. بالإضافة إلى ذلك ، نقدم نصا لمعالجة قياسات التألق ومقارنة الحساسية الهيكلية لمختلف IDRs. باتباع هذه الطريقة، يمكن للباحثين الحصول على رؤى قيمة حول التغيرات التوافقية التي تخضع لها IDRs في الوسط المعقد داخل الخلايا عند البيئات المتغيرة.

Introduction

المناطق المضطربة جوهريا (IDRs) هي مكونات حاسمة في العمليات الخلوية1. بالاقتران مع المجالات المهيكلة، تعد IDRs ضرورية لوظائف البروتين. تركيبة الأحماض الأمينية ل IDRs متحيزة ، ممثلة بشكل أساسي بالمخلفات المشحونة والمحبة للماء والصغيرة. بسبب هذه الخاصية ، تعتبر IDRs نطاقات منخفضة التعقيد 2,3. وقد حظيت العديد من الروابطات الإندونيسية بالاهتمام، ويرجع ذلك أساسا إلى أن هذه المناطق تلعب دورا حاسما في الحالات المرضية، وخاصة الأمراض التنكسية العصبية. تتميز هذه الأمراض بالتجميع الذاتي والترسب اللاحق خارج الخلية أو داخل الخلايا من IDRs في الخلايا العصبية4. ومن الأمثلة على هذه التفاعلات التفاعلية الأميلويد-β (Aβ) في مرض الزهايمر، وهنتنغتين (HTT) في مرض هنتنغتون، وبروتين ربط الحمض النووي لتقرير التقييم الثالث 43 (TDP-43) وتنصهر في الساركوما (FUS) في التصلب الجانبي الضموري والخرف الجبهيالصدغي 4. تم تعزيز دراسة إعادة الترتيب الهيكلي ل IDRs في سياق المرض بشكل كبير من خلال الطرق الطيفية ، بما في ذلك نقل طاقة الرنين الفلوري (FRET).

إن الطبيعة المحبة للماء والموسعة ل IDRs تجعلها حساسة للغاية للتغيرات في الخواص الفيزيائية والكيميائية لبيئة المحلول5. تسمى الدرجة التي يتم بها تعديل المجموعة التوافقية ل IDRs بواسطة البيئة الحساسية الهيكلية5،6،7. يمكن استخدام تقنيات مختلفة لدراسة تشكل وديناميكيات IDRs ، بما في ذلك ثنائية اللون الدائرية (CD) وتشتت الأشعة السينية بزاوية صغيرة (SAXS) 8,9. لسوء الحظ ، تتطلب CD و SAXS كميات كبيرة من البروتينات النقية ، لذلك فهي غير مناسبة للدراسات في الخلايا. في المقابل ، FRET هي تقنية تقيس شدة التألق لجزيئين من الفلورسنت يسميان على وجه التحديد IDR واحدا ، مما يعني أنه يمكن مراقبتهما في مخاليط معقدة مثل الخلايا الحية10. يعد القياس الديناميكي للحساسية الهيكلية ل IDRs في الخلايا الحية ضروريا لفهم كيفية تنظيم البيئة لتشكل ووظيفة البروتين المضطرب.

FRET هي طريقة قوية لقياس الحساسية الهيكلية ل IDRs ، وكذلك البروتينات الكروية ومتعددة المجالات في الخلايا الحية. تتطلب الطريقة بنية تتكون من IDR ذات أهمية محصورة بين اثنين من البروتينات الفلورية (FP) ، والمعروفة باسم زوج FRET. بالنسبة لهذا البروتوكول ، نقترح استخدام mCerulean3 باعتباره FP المانح والسترين كمتلقي FP ، بسبب نطاقها الديناميكي الكبير ، مقارنة ب FPs الأخرى التي تم الإبلاغ عنها في دراسة سابقة حول حساسية IDRs6. تم استغلال FRET سابقا لقياس الحساسية الهيكلية ل IDR للنبات في سياقات خلويةمختلفة 6. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام هذه التقنية لتوصيف أبعاد البروتين الكلية ل IDRs من قبل مجموعات بحثية مختلفة في كل من المختبر وفي الجسم الحي 5,11.

هنا ، نصف طريقة FRET الجماعية لدراسة الحساسية الهيكلية ل IDRs في خلايا الخميرة الحية (Saccharomyces cerevisiae). نعرض نتائج تمثيلية تستند إلى IDR نباتي يسمى AtLEA4-5. AtLEA4-5 مضطرب في المحلول ، لكنه يطوى إلى حلزون α عندما يحدث ازدحام جزيئي كبير في المختبر12. AtLEA4-5 هو نموذج مرجعي جيد لهذه الطريقة لأنه صغير نسبيا (158 بقايا) ، مضطرب وحساس للاضطراب البيئي كما ورد في السيليكو وفي المختبر 6,12. يمكن توسيع نطاق الطريقة المعروضة هنا لنهج الإنتاجية العالية لأن خلايا الخميرة سهلة النمو ، ويتم تطبيق العلاج بكميات صغيرة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تطبيق تعديلات صغيرة على البروتوكول على الأنظمة الخلوية الأخرى مثل البكتيريا والخلايا النباتية6. يمكن إجراء البروتوكول في أي مختبر للبيولوجيا الجزيئية مع إمكانية الوصول إلى قارئ الصفائح الدقيقة مع وضع التألق ، وهو جهاز متوفر في معظم المؤسسات البحثية.

Protocol

1. بناء البلازميد قم بتضخيم إطار القراءة المفتوح (ORF) الذي يرمز ل IDR المطلوب عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). لا تقم بتضمين كودون التوقف لأن ORF سيكون محاطا بالجينات التي تشفر البروتينات الفلورية. للتضخيم ، صمم البادئات مع مواقع تقييد SacI (5′) و BglII (3′).ملاحظة: بالن…

Representative Results

بعد تحويل خلايا الخميرة باستخدام بلازميد pDRFLIP38-AtLEA4-5 ، لوحظ مضان المحولات الإيجابية باستخدام محول الضوء الأزرق ومرشح (الشكل 1). يستغرق تحضير الحلول المختلفة للحث على الإجهاد الأسموزي المفرط وقتا طويلا ، لذلك نقترح اتباع نموذج 96 بئرا في الشكل 2. مباشرة بعد معا…

Discussion

تقدم الطريقة المعروضة هنا طريقة للحصول على رؤى حول كيفية استشعار الأبعاد العالمية لمجموعة IDRs للاضطرابات البيئية والاستجابة لها. تعتمد هذه الطريقة على بنية مشفرة وراثيا ولا تتطلب مكونات إضافية تتجاوز التعبير المستقر للبلازميد في خلايا الخميرة ، مما يجعلها قابلة للتكيف مع التطبيقات المح?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر أعضاء مختبر كويفاس-فيلاسكيز على المراجعة النقدية للمخطوطة. وحظي هذا العمل بدعم من برنامج دعم مشاريع البحث والتجديد التقني، والمديرية العامة لخبراء الأكاديميات الشخصية، والمشروع رقم IA203422 التابع للجامعة الوطنية المستقلة في المكسيك؛ المجلس الوطني للإنسان والعلوم والتكنولوجيا، المشروع رقم 252952؛ وبرنامج دعم البحث وبوسغرادو، كلية كيميكا، الجامعة الوطنية المستقلة في المكسيك، منحة 5000-9182. تعترف CET (CVU 1083636) و CAPD (CVU 1269643) ب CONAHCYT لمنحة M.Sc. الدراسية.

Materials

96-well plate Greiner Bio-One 655096
Agar Sigma-Aldrich 5040
BglII New England BioLabs R0144S
BJ5465 cells American Type Culture Collection 208289
Buffer MES 50 mM Sigma-Aldrich M8250
Buffer Tris-HCl 10 mM Invitrogen 15506017
EDTA 1 mM Merck 108452
Falcon tubes Corning 352057
LB media Sigma-Aldrich L2897
Lithium acetate 0.1 M Sigma-Aldrich L6883
Low Melt Agarose GOLDBIO A-204-25
Microcentrifuge eppendorf 5452000010
Miniprep kit ZymoPure D4210
NaOH 0.02 M Merck 106462
PEG 3,350 40% Sigma-Aldrich 1546547
plasmid pDRFLIP38-AtLEA4-5 addgene 178189
Plate reader BMG LABTECH CLARIOstar Plus
SacI New England BioLabs R3156S
Salmon sperm DNA 2 mg/mL Thermo Fisher Scientific 15632011
SD-Ura Sigma-Aldrich Y1501
Sodium cloride Sigma-Aldrich S9888
Taq polymesare Promega M5123
Transiluminator Accuris instruments E4000
UV-Visible spectrophotometer Thermo Fisher Scientific Biomate3
YPD media Sigma-Aldrich Y1500

References

  1. Wright, P. E., Dyson, H. J. Intrinsically disordered proteins in cellular signalling and regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (1), 18-29 (2015).
  2. Covarrubias, A. A., Romero-Pérez, P. S., Cuevas-Velazquez, C. L., Rendón-Luna, D. F. The functional diversity of structural disorder in plant proteins. Arch Biochem Biophys. 680, 108229 (2019).
  3. Ahmed, S. S., et al. Characterization of intrinsically disordered regions in proteins informed by human genetic diversity. PLoS Comput Biol. 18 (3), e1009911 (2022).
  4. Birol, M., Melo, A. M. Untangling the conformational polymorphism of disordered proteins associated with neurodegeneration at the single-molecule level. Front Mol Neurosci. 12, 309 (2019).
  5. Moses, D., et al. Revealing the hidden sensitivity of intrinsically disordered proteins to their chemical environment. J Phys Chem Lett. 11 (23), 10131-10136 (2020).
  6. Cuevas-Velazquez, C. L., et al. Intrinsically disordered protein biosensor tracks the physical-chemical effects of osmotic stress on cells. Nat Commun. 12 (1), 5438 (2021).
  7. Holehouse, A. S., Sukenik, S. Controlling structural bias in intrinsically disordered proteins using solution space scanning. J Chem Theory Comput. 16 (3), 1794-1805 (2020).
  8. Martin, E. W., Hopkins, J. B., Mittag, T. Small-angle X-ray scattering experiments of monodisperse intrinsically disordered protein samples close to the solubility limit. Methods Enzymol. 646, 185-222 (2021).
  9. Miles, A. J., Drew, E. D., Wallace, B. A. DichroIDP: a method for analyses of intrinsically disordered proteins using circular dichroism spectroscopy. Commun Biol. 6 (1), 823 (2023).
  10. Kaminski, C. F., Rees, E. J., Schierle, G. S. K. A quantitative protocol for intensity-based live cell FRET imaging. Method Mol Biol. 1076, 445-454 (2014).
  11. Moses, D., et al. Structural biases in disordered proteins are prevalent in the cell. bioRxiv. , (2022).
  12. Cuevas-Velazquez, C. L., Saab-Rincón, G., Reyes, J. L., Covarrubias, A. A. The Unstructured N-terminal Region of Arabidopsis Group 4 Late Embryogenesis Abundant (LEA) Proteins Is Required for Folding and for Chaperone-like Activity under Water Deficit. J Biol Chem. 291 (20), 10893-10903 (2016).
  13. JoVE Science Education Database. . Restriction enzyme digests. , (2023).
  14. JoVE Science Education Database. . Gel purification. , (2023).
  15. JoVE Science Education Database. . DNA ligation reactions. , (2023).
  16. JoVE Science Education Database. . Bacterial transformation using heat Ssock and competent cells. , (2023).
  17. JoVE Science Education Database. . PCR: Principle, instrumentation, and applications. , (2023).
  18. JoVE Science Education Database. . Plasmid purification. , (2023).
  19. JoVE Science Education Database. . DNA gel electrophoresis. , (2023).
  20. JoVE Core Molecular Biology. Sanger/chain termination sequencing using dideoxynucleotides – Concept Available from: https://app.jove.com/science-education/v/12020/sanger-sequencing (2023)
  21. Theillet, F. X., et al. Physicochemical properties of cells and their effects on intrinsically disordered proteins (IDPs). Chem Rev. 114 (13), 6661-6714 (2014).
  22. Brutscher, B., et al. NMR methods for the study of instrinsically disordered proteins structure, dynamics, and interactions: General overview and practical guidelines. Adv Exp Med Biol. 870, 49-122 (2015).
  23. Metskas, L. A., Rhoades, E. Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins. Annu Rev Phys Chem. 71, 391-414 (2020).
  24. Roebroek, T., et al. Simultaneous readout of multiple FRET pairs using photochromism. Nat Commun. 12 (1), 2005 (2021).
  25. Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool – understanding its potential while avoiding pitfalls. Nat Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
  26. Lyon, A. S., Peeples, W. B., Rosen, M. K. A framework for understanding the functions of biomolecular condensates across scales. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (3), 215-235 (2021).
  27. Belott, C., Janis, B., Menze, M. A. Liquid-liquid phase separation promotes animal desiccation tolerance. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (44), 27676-27684 (2020).
  28. Miermont, A., et al. Severe osmotic compression triggers a slowdown of intracellular signaling, which can be explained by molecular crowding. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5725-5730 (2013).
  29. Saito, H., Posas, F. Response to hyperosmotic stress. 遗传学. 192 (2), 289-318 (2012).
  30. Selenko, P., Wagner, G. Looking into live cells with in-cell NMR spectroscopy. J Struct Biol. 158 (2), 244-253 (2007).
  31. Cattani, J., Subramaniam, V., Drescher, M. Room-temperature in-cell EPR spectroscopy: alpha-Synuclein disease variants remain intrinsically disordered in the cell. Phys Chem Chem Phys. 19 (28), 18147-18151 (2017).
  32. Beveridge, R., Chappuis, Q., Macphee, C., Barran, P. Mass spectrometry methods for intrinsically disordered proteins. Analyst. 138 (1), 32-42 (2013).
  33. Beveridge, R., et al. Ion mobility mass spectrometry uncovers the impact of the patterning of oppositely charged residues on the conformational distributions of intrinsically disordered proteins. J Am Chem Soc. 141 (12), 4908-4918 (2019).

Play Video

Cite This Article
Enriquez-Toledo, C., Ponce-Diego, C. A., Cuevas-Velazquez, C. L. Estimation of Structural Sensitivity of Intrinsically Disordered Regions in Response to Hyperosmotic Stress in Living Cells Using FRET. J. Vis. Exp. (203), e66275, doi:10.3791/66275 (2024).

View Video