使用 FRET估计活细胞中响应高渗应激的固有无序区域的结构敏感性
Summary
内在无序区域 （IDR） 是灵活的蛋白质结构域，可根据环境变化改变其构象。集成荧光共振能量转移（FRET）可以估计不同条件下的蛋白质尺寸。我们提出了一种FRET方法来评估高渗胁迫下酿酒 酵 母活细胞的IDR结构敏感性。
Abstract
内在无序区域 （IDR） 是参与关键细胞过程的蛋白质结构域。在应激条件下，细胞环境的物理化学性质发生变化，直接影响IDR的构象集合。IDR本身就对环境扰动敏感。研究细胞的物理化学特性如何调节IDR的构象集合对于理解其功能的环境控制至关重要。在这里，我们描述了一种分步方法，用于测量活 酿酒酵 母细胞中IDR对高渗胁迫条件的响应的结构敏感性。我们介绍了使用集成荧光共振能量转移 （FRET） 来估计 IDR 的全局维度在施加于任何渗透压的细胞的高渗应力逐渐增加期间如何变化。此外，我们还提供了一个脚本，用于处理荧光测量和比较不同IDR的结构灵敏度。通过遵循这种方法，研究人员可以获得对IDR在复杂的细胞内环境中不断变化的环境所经历的构象变化的宝贵见解。
Introduction
固有无序区域 （IDR） 是细胞过程中的关键组成部分1。IDR与结构结构域相结合，对蛋白质功能至关重要。IDRs的氨基酸组成是有偏差的，主要由带电的、亲水的和小残基表示。由于这一特性，IDR 被认为是低复杂度域 2,3。许多IDR引起了人们的关注，主要是因为这些区域在病理状况中起着至关重要的作用，尤其是神经退行性疾病。此类疾病的特征是神经元中 IDR 的自组装和随后的细胞外或细胞内沉积4。此类 IDR 的例子包括阿尔茨海默病中的淀粉样蛋白 β （Aβ）、亨廷顿病中的亨廷顿蛋白 （HTT） 以及肌萎缩侧索硬化症和额颞叶痴呆的 TAR DNA 结合蛋白-43 和肉瘤融合蛋白 （FUS）4。包括荧光共振能量转移 （FRET） 在内的光谱方法显着增强了对疾病背景下 IDR 结构重排的研究。
IDR的亲水性和扩展性使其对溶液环境的理化性质变化极为敏感5。IDR的构象集合被环境改变的程度称为结构敏感性5,6,7。可以使用不同的技术来研究IDR的构象和动力学，包括圆二色性（CD）和小角X射线散射（SAXS）8,9。不幸的是，CD和SAXS需要大量的纯化蛋白质，因此它们不适合在细胞中进行研究。相比之下，FRET是一种测量两个荧光分子的荧光强度的技术，这些荧光分子特异性标记一个IDR，这意味着它们可以在复杂的混合物（如活细胞10）中进行监测。动态测量活细胞中IDR的结构敏感性对于了解环境如何调节无序蛋白质组的构象和功能是必要的。
FRET是一种强大的方法，用于量化活细胞中IDR以及球状和多结构域蛋白的结构敏感性。该方法需要一种由夹在两种荧光蛋白 （FP） 之间的目标 IDR 组成的构建体，称为 FRET对。对于该方案，我们建议使用 mCerulean3 作为供体 FP 和 Citrine 作为受体 FP，因为它们的动态范围很大，与之前关于 IDR 灵敏度6 的研究中报告的其他 FP 相比。FRET以前已被用于测量植物IDR在不同细胞环境中的结构敏感性6。此外，该技术已被不同的研究小组用于表征 IDR 的整体蛋白质尺寸 体外和体内 5,11。
在这里，我们描述了用于研究活酵母（酿酒酵母）细胞中IDR结构敏感性的集成FRET方法。我们展示了基于名为AtLEA4-5的植物IDR的代表性结果。AtLEA4-5 在溶液中是无序的，但在体外诱导大分子拥挤时折叠成α螺旋 12。AtLEA4-5 是该方法的良好参考模型，因为它相对较小（158 个残基）、无序且对环境扰动敏感，如计算机和体外报道的那样 6,12。这里介绍的方法可以针对高通量方法进行扩展，因为酵母细胞易于生长，并且处理量小。此外，对方案的微小修改可以应用于其他细胞系统，例如细菌和植物细胞6。该协议可以在任何分子生物学实验室中进行，可以使用具有荧光模式的酶标仪，这是大多数研究机构提供的设备。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里介绍的方法提供了一种方法来深入了解IDR集合的全局维度如何感知和响应环境扰动。该方法依赖于基因编码的构建体，除了酵母细胞中的质粒稳定表达外，不需要其他成分，使其适用于其他细胞类型的潜在应用。此外，它可用于探索真核细胞在其生命周期中经历的其他物理化学扰动21.FRET的分辨率是显着的，能量转移仅发生在供体和受体FP之间小于10nm的范围内。然而，主要的…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢奎瓦斯-贝拉斯克斯实验室的成员对手稿的批判性审查。这项工作得到了墨西哥国立自治大学（UNAM-PAPIIT）项目编号IA203422;项目编号为Consejo Nacional de Humanidades， Ciencias y Tecnología （CONAHCYT），项目编号252952;和 Programa de Apoyo a la Investigación y el Posgrado， Facultad de Química， Universidad Nacional Autónoma de México， Grant 5000-9182.CET （CVU 1083636） 和 CAPD （CVU 1269643） 承认 CONAHCYT 的 M.Sc 奖学金。
Materials
| 96-well plate | Greiner Bio-One | 655096 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| BglII | New England BioLabs | R0144S | |
| BJ5465 cells | American Type Culture Collection | 208289 | |
| Buffer MES 50 mM | Sigma-Aldrich | M8250 | |
| Buffer Tris-HCl 10 mM | Invitrogen | 15506017 | |
| EDTA 1 mM | Merck | 108452 | |
| Falcon tubes | Corning | 352057 | |
| LB media | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| Lithium acetate 0.1 M | Sigma-Aldrich | L6883 | |
| Low Melt Agarose | GOLDBIO | A-204-25 | |
| Microcentrifuge | eppendorf | 5452000010 | |
| Miniprep kit | ZymoPure | D4210 | |
| NaOH 0.02 M | Merck | 106462 | |
| PEG 3,350 40% | Sigma-Aldrich | 1546547 | |
| plasmid pDRFLIP38-AtLEA4-5 | addgene | 178189 | |
| Plate reader | BMG LABTECH | CLARIOstar Plus | |
| SacI | New England BioLabs | R3156S | |
| Salmon sperm DNA 2 mg/mL | Thermo Fisher Scientific | 15632011 | |
| SD-Ura | Sigma-Aldrich | Y1501 | |
| Sodium cloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Taq polymesare | Promega | M5123 | |
| Transiluminator | Accuris instruments | E4000 | |
| UV-Visible spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Biomate3 | |
| YPD media | Sigma-Aldrich | Y1500 |
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