生細胞におけるCRAFと14-3-3タンパク質との相互作用を測定するための生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)ベースのアッセイ
Summary
このプロトコルは、生細胞中のCRAFキナーゼと14-3-3タンパク質との相互作用を測定するためのBRETベースのアッセイを説明しています。このプロトコルでは、細胞の調製、BRET排出量の読み取り、およびデータ解析の手順を概説しています。また、アッセイ最適化のための適切なコントロールとトラブルシューティングの特定を含む結果の例も示します。
Abstract
CRAF は RAS GTPase の主要なエフェクターであり、いくつかの KRAS によるがんの腫瘍形成に重要な役割を果たします。さらに、CRAF は生殖細胞変異のホットスポットであり、発達性 RASopathy、ヌーナン症候群を引き起こすことが示されています。すべてのRAFキナーゼには、14-3-3制御タンパク質のリン酸化依存性結合部位が複数含まれています。これらの部位への14-3-3の差次的結合は、シグナル伝達条件下での原形質膜での活性RAF二量体の形成、および静止条件下でのRAF自己阻害の維持において重要な役割を果たします。これらの相互作用がどのように制御され、どのように調節できるかを理解することは、RAF機能を標的とする新しい治療アプローチを特定するために重要です。ここでは、生細胞におけるCRAFと14-3-3タンパク質との相互作用を測定するための生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)ベースのアッセイについて説明します。具体的には、このアッセイは、ナノルシフェラーゼドナーに融合したCRAFとHaloタグアクセプターに融合した14-3-3の相互作用を測定し、RAFと14-3-3の相互作用により、ドナーからアクセプターへのエネルギー移動とBRETシグナルの生成がもたらされます。プロトコルはさらに、このシグナルが、その高親和性RAFドッキング部位のそれぞれへの14-3-3結合を防止することを示す突然変異によって中断され得ることを示している。このプロトコールでは、細胞の播種、トランスフェクション、および再プレーティングの手順と、BRET排出量の読み取り、データ解析の実施、およびタンパク質発現レベルの確認に関する詳細な手順について説明します。さらに、アッセイ結果の例と、最適化およびトラブルシューティングの手順を提供します。
Introduction
RAFキナーゼ(ARAF、BRAF、CRAF)は、RAS GTPアーゼの直接エフェクターであり、増殖促進型/生存促進型のRAF-MEK-ERKキナーゼカスケードの開始メンバーです。最近の研究では、CRAF の発現が、非小細胞肺がんや膵管腺がん 1,2,3,4,5 など、いくつかの KRAS 駆動型がんの腫瘍形成に重要な役割を果たしていることが示されています。さらに、生殖細胞系CRAF変異は、特に重篤なRASopathyであるヌーナン症候群を引き起こします6,7。CRAF制御を理解することは、細胞内でのCRAF機能を標的とする治療アプローチを成功させるために重要です。
全てのRAFキナーゼは、C末端触媒(CAT)ドメインとN末端調節(REG)ドメインの2つの機能ドメインに分けることができ、これはその活性を制御する(図1A)8。REGドメインには、RAS結合ドメイン(RBD)、システインリッチドメイン(CRD)、およびセリン/スレオニンリッチ領域(S/Tリッチ)が含まれます。特に、S/Tリッチ領域にはN’部位が含まれており、N’部位はリン酸化依存的に14-3-3に結合します(CRAFのS259;図1A)8. CATドメインは、キナーゼドメインを包含し、C’サイトと呼ばれる第2の高親和性14-3-3ドッキングサイト(CRAFではS621;図1A)8.二量体14-3-3タンパク質のN’およびC’部位への差長結合は、CRDとともに、RAFの活性化と阻害の両方に重要な役割を果たします9,10,11,12,13。通常のシグナル伝達条件下では、RAFの活性化はRASによる原形質膜への動員によって開始され、活性二量体を形成することができ、その中でBRAF-CRAFヘテロ二量体が主要な活性型である14,15。BRAFおよびCRAFを用いた生化学的アッセイは、二量体BRAFの極低温電子顕微鏡(Cryo-EM)構造とともに、14-3-3二量体が両方のRAFプロトマーのC’部位に同時に結合することにより活性RAF二量体を安定化させることを示している(図1B)9,13,16,17。逆に、研究は、静止条件下で、RAFが細胞質の自己阻害確認を採用し、REGドメインがCATドメインに結合し、その活性を阻害することを示しました12,18,19,20。この閉状態は、REGドメインのCRDおよびN’サイト、およびCATドメインのC’サイトに結合した14-3-3ダイマーによって安定化される(図1B)10,13,21。BRAFでは、このモデルは、自己阻害BRAFモノマーの最近のクライオ電子顕微鏡構造と、以前の生化学的研究10,12,13,21,22によってサポートされています。しかし、14-3-3はCRAF調節において阻害的な役割を果たすことが示されています23が、BRAFのような自己抑制状態はCRAF調節12においてより少ない役割を果たす可能性があります。したがって、14-3-3タンパク質がCRAF活性を制御するメカニズムを明らかにするためには、さらなる研究が必要です。14-3-3を介したRAFキナーゼの調節には、多数のRAFリン酸化および脱リン酸化イベント、さまざまな調節タンパク質への結合、および原形質膜との相互作用が必要です8。したがって、14-3-3-RAF相互作用は、生理学的に関連性のある条件下で、無傷の脂質二重層の存在下で測定することが重要です。
この問題に対処するために、NanoBRET(以下、N-BRETと表記、キットの詳細については表を参照)技術を利用して、生細胞内のCRAFと14-3-3タンパク質との相互作用を測定するための近接ベースのアッセイを開発しました(図1C)。このBRETベースのシステムは、Halo618エネルギーアクセプターリガンド22,24で標識するために、一方のタンパク質にナノルシフェラーゼ(Nano)ドナー、もう一方にHaloタグが付けられた2つの目的タンパク質(POI)の相互作用を測定する。目的のタンパク質の相互作用により、ドナーからアクセプターへのエネルギー移動が起こり、それが次にBRETシグナルを生成します(図1C)。非常に明るいNanoドナータンパク質(発光(em)460 nm)とHalo618リガンド(em 618 nm)は、従来のBRETよりも優れたスペクトル分離と感度を提供し、弱い相互作用を研究し、結合の微妙な変化を検出するための理想的なプラットフォームとなっています24。実際、我々は以前に、BRAF CRDにおけるRASopathy変異のパネルの特性評価に不可欠であったRAF REGおよびCATドメインの自己抑制性相互作用を測定するためのN-BRETベースのアッセイを開発し、自己抑制を維持し、構成的BRAF活性化を防止するためのこのドメインの決定的な重要性を実証した12。
ここで説明するアッセイは、N末端ナノタグに融合したCRAFと、C末端ハロータグに融合した14-3-3のゼータアイソフォーム(14-3-3ζ-Halo; 図1C)。Nano-CRAFと14-3-3ζ-Haloとの相互作用は、強力なBRETシグナルを生成し、14-3-3がN’部位(S259A)および/またはC’部位(S621A)に結合するのを妨げる突然変異によって破壊される可能性があることを示しています。次のプロトコルは、このアッセイの実行、最適化、およびトラブルシューティングの詳細な手順を示しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
これまでの研究では、14-3-3タンパク質がRAFキナーゼの活性化と阻害の両方に重要な役割を果たすことが示されています。これらの結合イベントがどのように制御され、これらの相互作用を調節することがRAFシグナル伝達とRAF駆動型発癌に及ぼす影響を理解することで、CRAF機能を標的とする新たな治療上の脆弱性が明らかになるかもしれません。しかし、Rafの活性化サイクルは、多数の関連タ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロジェクトは、プロジェクト番号ZIA BC 010329の下で、国立がん研究所、国立衛生研究所からの連邦資金によって部分的に資金提供されています。
Materials
| Antibodies | |||
| HaloTag® mouse monoclonal antibody | Promega | G9211 | Antibody for detecting HaloTag tagged proteins by immunoblot |
| NanoLuc® mouse monoclonal antibody | R&D Systems | MAB10026 | Antibody for detecting Nano-tagged proteins by immunoblot |
| CRAF mouse monoclonal antibody (E10) | Santa Crus Biotechnology | sc-7267 | Antibody directly detecting CRAF proteins by immunoblot |
| ECL anti-mouse HRP secondary antibody | Amersham | NA931-1ML | Secondary HRP conjugated mouse antibody (from sheep) |
| Reagents | |||
| X-tremeGENE™ 9 | Roche/Sigma | 6365809001 | |
| NanoBRET™ kit | Promega | N1661 | NanoBRET kit containing Halo 618 ligand and NanoGlo (nanoluciferase) substrate |
| DPBS, without Ca++ and Mg++ | Quality Biologicals | 114-057-101 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Life Technologies | 25300120 | |
| DMEM cell culture media | Life Technologies | 11995073 | High glucose, L-glutamine, phenol red, sodium pyruvate; without HEPES, suppliment media with 10% FBS, 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin |
| L-Glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030164 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140163 | |
| Opti-MEM™ I reduced serum media | Gibco | 31985062 | For cell transfection |
| Opti-MEM reduced serum media, no phenol red | Gibco | 11058021 | For replating cells on Day 3. Supplement with 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin, along with 10% FBS (where indicated). |
| Invitrogen Trypan Blue Stain | Thermo Scientific | T10282 | |
| NP40 lysis buffer | N/A | N/A | 20 mM Tris (pH 8.0), 137mM NaCl, 10% glycerol, NP40 alternative (Milipore, Cat# 492016). Store at 4 degrees C.. Add the following protease and phosphatase immediately prior to use: 20 µM leupeptin, 0.5 mM sodium orthovanidate, 0.15 U/mL, 1mM PMSF. |
| 5x gel sample buffer | N/A | N/A | 240 mM Tris (pH 8.0), 9.5% SDS, 30% glycerol, 500mM DTT, 3mM bromophenol blue. Store at -20 degrees C. |
| Cell lines | |||
| 293FT cells (human) | Thermo Scientific | R70007 | |
| DNA vectors | |||
| pCMV5-Nano-CRAF WT and mutant | N/A | N/A | |
| pCMV5-14-3-3ζ-Halo | N/A | N/A | |
| Equipment | |||
| EnVision 2104 Multimode Plate Reader | PerkinElmer 2104 | 2104-0010 | 600LP NanoBRET & M460/50 nm NanoBRET emmisions filters, Luminescence 404 mirror, 6.5 mm measurement height and 0.1 s measurement time |
| Invitrogen Countess™ II Automated Cell Counter | Thermo Scientific | AMQAX1000 | |
| ThermoFisher E1-ClipTip™ Multichannel Pipettor | Thermo Scientific | 4672070 | |
| Software | |||
| GraphPad Prism (version 10.0.3) | GraphPad | www.graphpad.com | |
| Other | |||
| ThermoFisher ClipTip Multichannel pipette tips | Thermo Scientific | 94410153 | |
| Reagent Reservoir, 25 mL Divided, Sterile | Thomas Scientific | 1228K16 | |
| Perkin Elmer 384-well CulturPlate™ | PerkinElmer | 6007680 | White, polystyrene, tissue culture treated |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Scientific | C10228 |
References
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