Ensaio baseado em transferência de energia por ressonância de bioluminescência (BRET) para medir interações de CRAF com proteínas 14-3-3 em células vivas
Summary
Este protocolo descreve um ensaio baseado em BRAKET para medir as interações da quinase CRAF com proteínas 14-3-3 em células vivas. O protocolo descreve as etapas para preparar as células, ler as emissões de BRET e analisar dados. Um exemplo de resultado com identificação de controles apropriados e solução de problemas para otimização de ensaio também é apresentado.
Abstract
O CRAF é um efetor primário das GTPases RAS e desempenha um papel crítico na tumorigênese de vários cânceres causados por KRAS. Além disso, o CRAF é um hotspot para mutações germinativas, que causam a RASopatia do desenvolvimento, síndrome de Noonan. Todas as quinases RAF contêm vários locais de ligação dependentes de fosforilação para proteínas reguladoras 14-3-3. A ligação diferencial de 14-3-3 a esses locais desempenha papéis essenciais na formação de dímeros RAF ativos na membrana plasmática sob condições de sinalização e na manutenção da autoinibição do RAF em condições quiescentes. Compreender como essas interações são reguladas e como elas podem ser moduladas é fundamental para identificar novas abordagens terapêuticas que visam a função da RAF. Aqui, descrevo um ensaio baseado em transferência de energia de ressonância de bioluminescência (BRET) para medir as interações de CRAF com proteínas 14-3-3 em células vivas. Especificamente, este ensaio mede as interações de CRAF fundido a um doador de Nano luciferase e 14-3-3 fundido a um aceitador de tag Halo, onde a interação de RAF e 14-3-3 resulta na transferência de energia doador para aceitador e na geração do sinal BRET. O protocolo mostra ainda que esse sinal pode ser interrompido por mutações que impedem a ligação do 14-3-3 a cada um de seus locais de ancoragem de alta afinidade da RAF. Este protocolo descreve os procedimentos para semear, transfectar e replaquear as células, juntamente com instruções detalhadas para ler as emissões de CHUT, realizar análises de dados e confirmar os níveis de expressão de proteínas. Além disso, são fornecidos exemplos de resultados de ensaios, juntamente com etapas de otimização e solução de problemas.
Introduction
As quinases RAF (ARAF, BRAF e CRAF) são os efetores diretos das GTPases RAS e os membros iniciadores da cascata de quinase RAF-MEK-ERK pró-proliferativa/pró-sobrevivência. Estudos recentes mostraram que a expressão de CRAF desempenha um papel fundamental na tumorigênese de vários cânceres causados por KRAS, incluindo câncer de pulmão de células não pequenas e adenocarcinoma ductal pancreático 1,2,3,4,5. Além disso, as mutações germinativas do CRAF causam uma forma particularmente grave da RASopatia, a síndrome de Noonan 6,7. Compreender a regulação do CRAF é fundamental para o desenvolvimento de abordagens terapêuticas bem-sucedidas que visam sua função nas células.
Todas as quinases RAF podem ser divididas em dois domínios funcionais, um domínio catalítico C-terminal (CAT) e um domínio regulador N-terminal (REG), que controla sua atividade (Figura 1A)8. O domínio REG engloba o domínio de ligação RAS (RBD), o domínio rico em cisteína (CRD) e uma região rica em serina/treonina (rica em S/T). Notavelmente, a região rica em S / T contém o sítio N ‘, que se liga a 14-3-3 de maneira dependente da fosforilação (S259 em CRAF; Figura 1A) 8. O domínio CAT engloba o domínio quinase, juntamente com um segundo local de ancoragem 14-3-3 de alta afinidade, conhecido como sítio C’ (S621 em CRAF; Figura 1A) 8. A ligação diferencial de proteínas diméricas 14-3-3 aos sítios N ‘e C’, juntamente com o CRD, desempenha papéis críticos na ativação e inibição do RAF 9,10,11,12,13. Em condições normais de sinalização, a ativação do RAF é iniciada pelo seu recrutamento para a membrana plasmática pelo RAS, permitindo a formação de dímeros ativos, dos quais o heterodímero BRAF-CRAF é a forma ativa predominante14,15. Ensaios bioquímicos com BRAF e CRAF, juntamente com estruturas de microscopia eletrônica criogênica (Cryo-EM) de BRAF dimérico, indicam que um dímero 14-3-3 estabiliza dímeros RAF ativos ligando-se simultaneamente ao sítio C ‘de ambos os protômeros RAF ( Figura 1B ) 9 , 13 , 16 , 17 . Por outro lado, estudos mostraram que, em condições quiescentes, o RAF adota uma confirmação citosólica e autoinibida, onde o domínio REG se liga ao domínio CAT e inibe sua atividade 12,18,19,20. Este estado fechado é estabilizado por um dímero 14-3-3 ligado ao CRD e ao sítio N’ no domínio REG e ao sítio C’ no domínio CAT (Figura 1B)10,13,21. No BRAF, este modelo é apoiado por estruturas Cryo-EM recentes de monômeros BRAF autoinibidos e por nossos estudos bioquímicos anteriores 10,12,13,21,22. No entanto, enquanto 14-3-3 é mostrado para desempenhar um papel inibitório na regulação CRAF23, um estado autoinibido semelhante a BRAF pode desempenhar um papel menor na regulação CRAF12; portanto, mais estudos são necessários para esclarecer os mecanismos pelos quais as proteínas 14-3-3 regulam a atividade do CRAF. A regulação mediada por 14-3-3 das quinases RAF requer uma infinidade de eventos de fosforilação e desfosforilação de RAF, a ligação a várias proteínas reguladoras e interações com a membrana plasmática8. Portanto, é fundamental que as interações 14-3-3-RAF sejam medidas em condições fisiologicamente relevantes e na presença de uma bicamada lipídica intacta.
Para resolver esse problema, a tecnologia NanoBRET (doravante referida como N-BRET; consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes do kit) foi utilizada para desenvolver um ensaio baseado em proximidade para medir as interações de CRAF com proteínas 14-3-3 em células vivas (Figura 1C). Este sistema baseado em BRET mede as interações de duas proteínas de interesse (POI), onde uma proteína é marcada com um doador de nanoluciferase (Nano) e a outra com uma etiqueta Halo, para marcação com o ligante aceitador de energia Halo618 22,24. A interação das proteínas de interesse resulta na transferência de energia do doador para o aceitador, que por sua vez gera o sinal BRET (Figura 1C). A proteína doadora Nano extremamente brilhante (emissão (em) 460 nm) e o ligante Halo618 (em 618 nm) fornecem maior separação espectral e sensibilidade em relação ao BRET convencional, tornando-o uma plataforma ideal para estudar interações mais fracas e detectar mudanças sutis na ligação24. De fato, desenvolvemos anteriormente um ensaio baseado em N-BRET para medir as interações autoinibitórias dos domínios RAF REG e CAT, que foi essencial para a caracterização de um painel de mutações RASopatia no BRAF CRD e demonstrou a importância crítica desse domínio para manter a autoinibição e prevenir a ativação constitutiva de BRAF12.
O ensaio descrito aqui mede as interações de CRAF, fundido a uma etiqueta Nano N-terminal (Nano-CRAF), e a isoforma zeta de 14-3-3 fundida à etiqueta Halo C-terminal (14-3-3ζ-Halo; Figura 1C). Mostramos que as interações do Nano-CRAF com o 14-3-3ζ-Halo geram um sinal BRET robusto, que por sua vez pode ser interrompido por mutações que impedem a ligação do 14-3-3 ao sítio N ‘(S259A) e / ou ao sítio C ‘(S621A). O protocolo a seguir fornece etapas detalhadas para executar, otimizar e solucionar problemas deste ensaio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Estudos anteriores mostraram que as proteínas 14-3-3 desempenham papéis críticos na ativação e inibição das quinases RAF. Compreender como esses eventos de ligação são regulados e os efeitos da modulação dessas interações na sinalização RAF e na oncogênese orientada por RAF pode revelar novas vulnerabilidades terapêuticas que visam a função CRAF. No entanto, o ciclo de ativação de Raf é suportado por uma infinidade de proteínas associadas, modificações pós-traducionais e mudanças na localizaç…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este projeto foi financiado em parte com fundos federais do Instituto Nacional do Câncer, Institutos Nacionais de Saúde, sob o número de projeto ZIA BC 010329.
Materials
| Antibodies | |||
| HaloTag® mouse monoclonal antibody | Promega | G9211 | Antibody for detecting HaloTag tagged proteins by immunoblot |
| NanoLuc® mouse monoclonal antibody | R&D Systems | MAB10026 | Antibody for detecting Nano-tagged proteins by immunoblot |
| CRAF mouse monoclonal antibody (E10) | Santa Crus Biotechnology | sc-7267 | Antibody directly detecting CRAF proteins by immunoblot |
| ECL anti-mouse HRP secondary antibody | Amersham | NA931-1ML | Secondary HRP conjugated mouse antibody (from sheep) |
| Reagents | |||
| X-tremeGENE™ 9 | Roche/Sigma | 6365809001 | |
| NanoBRET™ kit | Promega | N1661 | NanoBRET kit containing Halo 618 ligand and NanoGlo (nanoluciferase) substrate |
| DPBS, without Ca++ and Mg++ | Quality Biologicals | 114-057-101 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Life Technologies | 25300120 | |
| DMEM cell culture media | Life Technologies | 11995073 | High glucose, L-glutamine, phenol red, sodium pyruvate; without HEPES, suppliment media with 10% FBS, 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin |
| L-Glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030164 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140163 | |
| Opti-MEM™ I reduced serum media | Gibco | 31985062 | For cell transfection |
| Opti-MEM reduced serum media, no phenol red | Gibco | 11058021 | For replating cells on Day 3. Supplement with 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin, along with 10% FBS (where indicated). |
| Invitrogen Trypan Blue Stain | Thermo Scientific | T10282 | |
| NP40 lysis buffer | N/A | N/A | 20 mM Tris (pH 8.0), 137mM NaCl, 10% glycerol, NP40 alternative (Milipore, Cat# 492016). Store at 4 degrees C.. Add the following protease and phosphatase immediately prior to use: 20 µM leupeptin, 0.5 mM sodium orthovanidate, 0.15 U/mL, 1mM PMSF. |
| 5x gel sample buffer | N/A | N/A | 240 mM Tris (pH 8.0), 9.5% SDS, 30% glycerol, 500mM DTT, 3mM bromophenol blue. Store at -20 degrees C. |
| Cell lines | |||
| 293FT cells (human) | Thermo Scientific | R70007 | |
| DNA vectors | |||
| pCMV5-Nano-CRAF WT and mutant | N/A | N/A | |
| pCMV5-14-3-3ζ-Halo | N/A | N/A | |
| Equipment | |||
| EnVision 2104 Multimode Plate Reader | PerkinElmer 2104 | 2104-0010 | 600LP NanoBRET & M460/50 nm NanoBRET emmisions filters, Luminescence 404 mirror, 6.5 mm measurement height and 0.1 s measurement time |
| Invitrogen Countess™ II Automated Cell Counter | Thermo Scientific | AMQAX1000 | |
| ThermoFisher E1-ClipTip™ Multichannel Pipettor | Thermo Scientific | 4672070 | |
| Software | |||
| GraphPad Prism (version 10.0.3) | GraphPad | www.graphpad.com | |
| Other | |||
| ThermoFisher ClipTip Multichannel pipette tips | Thermo Scientific | 94410153 | |
| Reagent Reservoir, 25 mL Divided, Sterile | Thomas Scientific | 1228K16 | |
| Perkin Elmer 384-well CulturPlate™ | PerkinElmer | 6007680 | White, polystyrene, tissue culture treated |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Scientific | C10228 |
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