駆出率を維持した高脂血症誘発性心不全のマウスモデル

Summary

このプロトコルは、駆出率が維持された高脂血症誘発性心不全(HFpEF)のマウスモデルを再現するための詳細なアプローチを示しています。このデザインは、アデノ随伴ウイルス9-心筋トロポニンT-低密度リポタンパク質受容体(AAV9-cTnT-LDLR)とポロキサマー-407(P-407)の投与を組み合わせたものです。

Abstract

脂肪毒性によって引き起こされる駆出率(HFpEF)が保存された心不全の病態生理学は、完全には理解されていません。心血管代謝HFpEFを正確に模倣する動物モデルが急務であることから、HFpEF患者に見られる表現型をリバースエンジニアリングして、高脂血症誘発マウスモデルを開発しました。このモデルは、脂肪毒性とメタボリックシンドロームの相互作用に焦点を当てて、HFpEFを調査することを目的としていました。高脂血症は、129J株バックグラウンドの野生型(WT)マウスにおいて、リポタンパク質リパーゼをブロックするブロック共重合体であるポロキサマー-407(P-407)の隔週腹腔内注射と、アデノ随伴ウイルス9-心筋トロポニンT-低密度リポタンパク質受容体(AAV9-cTnT-LDLR)の単回静脈内注射により誘発されました。心エコー検査、血圧記録、全身プレチスモグラフィー、心エコー検査(ECG)テレメトリー、活動ホイールモニタリング(AWM)、生化学的および組織学的分析など、治療後4〜8週間の間に広範な評価が行われました。.LDLR/P-407マウスは、4週目で拡張期機能障害、駆出率の維持、左心室壁の厚さの増加など、特徴的な特徴を示しました。特に、血圧と腎機能は正常範囲内にとどまっていました。さらに、ECGとAWMは、それぞれ心臓ブロックと活動の低下を明らかにしました。拡張期機能は8週間で悪化し、呼吸数が大幅に低下しました。二重治療モデルのさらなる調査により、線維症、湿性肺/乾性肺比、および心臓重量/体重比の上昇が明らかになりました。LDLR/P-407マウスは、黄色腫、腹水、および心虚血を示しました。興味深いことに、突然死は治療後6週間から12週間の間に発生しました。マウスHFpEFモデルは、脂肪毒性を介したHFpEFの文脈で拡張期機能障害に寄与するメタボリックシンドロームの複雑さを解明するための貴重で有望な実験リソースを提供します。

Introduction

駆出率が保存された心不全(HFpEF)は、複数の併存疾患を伴う心血管代謝症候群を示し、すべての心不全症例の50%以上を占めています^1,2。さらに、HFpEFの頻度は過去10年間で着実に増加しています³。治療の選択肢が限られているHFpEFは、その多面的な病態^生理学4を考えると、心血管疾患における最も重要なアンメットメディカルニーズを表しています。したがって、効果的な治療法を開発するために、HFpEFの根底にあるメカニズムと病態生理学の理解を深めることが急務です。

近年の大きな進歩にもかかわらず、脂肪毒性に起因するHFpEFの病態生理学は未だに完全には解明されていません。HFpEF の患者は、駆出率が低下した心不全 (HFrEF) の患者や健康な対照群と比較して、顕著な心筋脂質蓄積を示すことが確立されています⁵。心臓生検のRNAシーケンシングデータは、^健康なHFrEF患者およびHFrEF患者と比較して、HFpEF群のリポタンパク質リパーゼ(LPL)遺伝子のダウンレギュレーションを示しました6。Poloxamer-407(P-407)は、LPLをブロックし、続いて血漿トリグリセリドおよび低密度リポタンパク質(LDL)コレステロールを増加させることにより高脂血症を誘発するブロック共重合体^です7。以前の研究では、HFpEFマウスの心臓におけるLDL-Receptor(LDLR)の発現が高いことが示^{されている8。}

これらの知見に基づき、心血管代謝HFpEFを正確に模倣した動物モデルの必要性が急務であることを認識し、高脂血症誘発マウスモデルが開発され、発表されました。このモデルは、HFpEFを探索するように調整されており、メタボリックシンドロームと脂肪毒性の関与に明確に焦点を当てています。高脂血症/LPL遮断と心臓LDLR発現の亢進によって誘発されたこのモデルは、129JバックグラウンドのWT-129マウスで、P-407の隔週腹腔内(i.p.)注射とアデノ随伴ウイルス9-心筋トロポニンT-LDLR(AAV9-cTnT-LDLR)^の単回静脈内(i.v.)注射の組み合わせによって確立されました9。

治療後4週間から8週間の間に、心エコー検査、血圧記録、全身プレチスモグラフィー(WBP)、持続心電図(ECG)テレメトリー、活動ホイールモニタリング(AWM)、生化学的および組織^{学的分析9}を含む広範な評価が実施された。4週間後、LDLR/P407または「二重治療」マウスは、拡張期機能障害、駆出率の維持、左心^{室壁の厚さ}の増加など、明確なHFpEFの特徴を示しました9。さらに、ECGテレメトリーとAWMは、それぞれ心臓ブロックと活動の低下を明らかにしました。特に、血圧と腎機能は正常なままでした⁹。8週間までに、拡張期機能は悪化し、WBP測定により呼吸数の減少が明らかになりました⁹。

二重治療モデルのさらなる調査により、線維症、湿性肺/乾性肺比の上昇、および心臓重量/体重比が明らかになりました⁹。剖検により、腹水症、心虚血、黄色腫が明らかになりました。興味深いことに、突然死は治療後6週間から12週間の間に記録されている⁹。このマウス高脂血症によるHFpEFモデルは、脂肪毒性を介したHFpEFによる拡張期機能障害の原因となるメタボリックシンドロームの複雑さを解明するための迅速で価値があり、有望な実験ツールを提供します。

Protocol

動物プロトコルは、マイアミ大学の動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認され、国立衛生研究所(NIH)のガイドライン(IACUCプロトコル23-103-AD03)に準拠しています。本研究では、129Jをバックグラウンドにした野生型(WT)マウスを市販の供給源から入手し( Table of Materials参照)、自社で飼育した。すべてのマウスは129Jの背景で同腹仔でした。実験には、オスマウスとメスマウスの両方が含まれていました。LDLR/P-407 HFpEFマウスは、AAV9-cTnT-LDLRを1週目に単回投与し、p407を隔週で4週間投与することで樹立されました。 1. AAV9-cTnT-LDLRの調製と投与 注:AAV9-cTNT-hLDLRプラスミド( 材料表を参照)は、完全なヒトLDLRタンパク質(2664bp)をコードしています(図1)。 AAV-LDLRウイルスベクター調製動物の数に基づいて、AAV9ストックバイアルを氷上で20分間解凍し、次にAAV粒子をダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で希釈して、100μLで1 x 1012 ベクターゲノム/マウスの濃度を取得します。 ウイルス溶液を1mLシリンジ上の28〜30Gの針に入れます。針に気泡が入り込まないように注意してください。 静脈内(i.v.)尾静脈注射の手順酸素を0.5 L / minまでオンにし、イソフルラン麻酔システムを4%〜5%に設定します。マウスを誘導チャンバーに ~2 分間置き、動物が反応しなくなるまで待ちます。 動物をマウステールイルミネーター拘束具(例:.、Braintree Scientific、Inc.(マサチューセッツ州ブレインツリー))に置き、動物を横に寝かせます。.イソフルラン麻酔を2%〜3%に使用してメンテナンスします。注:拘束装置による加熱は、マウスの尾静脈の拡張を引き起こし、したがって、注入を大幅に容易にします。 尾側静脈を特定します。ガーゼパッドを使用して消毒剤で注射領域を清掃します。 尻尾の端を持って伸ばし、静脈が見えるまで指でマウスの尻尾をマッサージします。針を低い角度(10〜15度の角度)で挿入し、希釈したAAV100μLを尾静脈に注入します(図2A)。 針を引き抜き、出血が止まるまですぐに指で圧力をかけます。マウスを元のケージに戻します。 2. P-407の調製と投与 P-407の準備P-407 薬剤( 材料表を参照)を DPBS で希釈し、ドラフト内で最終濃度 100 mg/mL まで溶液を調製します。溶液をローテーターで4°Cで一晩冷蔵して、P-40710の溶解を促進します。 隔週の腹腔内(i.p.)注射手順I.P.注射の初日に各マウスの体重を量ります。式1 g / kgを使用して、重量とプレフィルシリンジに従って各マウスの適切な用量を計算します。 ヒュームフードの下で、頭と体を下向きに傾けた状態でマウスを手動で拘束し、内臓を頭蓋の位置に戻します。この技術により、近傍の重要な構造物の穿刺を回避できます。 腹部の下腹部、正中線の外側にある左腹膜腔を特定します。消毒剤でサイトを清掃します。 45度以下の角度で、針を腹腔に挿入します(図2B)。シリンジを吸引して、適切に挿入されるようにします。 吸引時に血液または組織が存在する場合は、針を引き出し、シリンジが透明になるまで手順2.2.2〜2.2.4を繰り返します。.針を適切な鋭利物容器に廃棄し、マウスを元のケージに戻します。 3.心エコー検査の評価 準備イメージングの前日または数時間前に、マウスの胸部と上腹部に脱毛クリームを塗布します。2分後に濡れたガーゼでクリームを取り除きます。 0.8 L / minの流量で2.5%〜3.0%のイソフルランでマウスを麻酔し、1%〜1.5%のイソフルランで維持します。次に、マウスを仰臥位の適切なプラットフォームに固定し、前足を導電性ゲルで電極パッドに置き、鼻と口をノーズコーンで覆って、イソフルランによる継続的な麻酔を確保します。 胸骨傍長軸ビューマウスを仰向けにして、プラットフォームの右側を45度傾けます。 次に、トランスデューサープローブをレールシステムに斜めに位置合わせし、右上肢から左腹部まで時計回りに30〜40度傾けて、Bモード画像を取得して保存します。 超音波解析ソフトウェア( 材料の表を参照)を使用してBモード画像を解析し、駆出率を取得します(図3A)。 胸骨傍短軸ビューレールシステムのトランスデューサープローブを時計回りに90度回転させて、BモードとMモードの画像を取得して保存します。 アピカルビュープラットフォームの左上隅を下向きに右に傾けます。トランスデューサーを動物の右肩に向けます。 Bモードとカラードップラーモードで僧帽弁を視覚化します。パルス波(PW)ドップラーおよび組織ドップラー画像の取得と保存5. 超音波解析ソフトウェアを使用してPWドップラー画像と組織ドップラー画像を解析し、IVRT、E/E’、およびE / Aを取得します(図3B-E)。 4. 圧力-体積(PV)ループデータ記録 研究の終了時に血行動態分析を実施して、前述の手順11,12に従って、左心室(LV)の収縮期および拡張期機能を評価します。まず、マウスにイソフルラン(3-5%、誘導チャンバー)を誘導します。 麻酔作用が始まったら、動物を手術台に移し、イソフルラン(1〜3%、フェイスマスク)で麻酔を維持します。 首の上の皮膚に小さな切開を行い、気管内挿管(口から)を可能にします。 げっ歯類の人工呼吸器 (例: マイクロ ベント モデル 848、ハーバード装置) を使用して、酸素とイソフルランの混合物で動物を換気します (例: マイクロ ベント モデル 848、ハーバード装置) 容量を ~0.15-0.2 mL に設定し、呼吸数を 120-170 呼吸/分に設定します。 温度制御された手術台を使用して、手術中±1°C~37°Cから1°Cの体温を監視します。 左内頸静脈を露出させ、30Gの針でカニューレを挿入して、輸液サポート投与を行います。 正中腹側頸部の部位の皮膚を切り取り、頸動脈を露出させます。右頸動脈の遠位部分を閉塞した後、動脈に小さな切り込みを入れて、マイクロチップの圧力容量(PV)カテーテル( 材料の表を参照)を左心室に導入できるようにします(クローズドチェストアプローチ)。 定常状態および下大静脈閉塞中のPVループを記録します。 実験の最後に、承認されたAVMA法(例:イソフルランとそれに続く子宮頸部脱臼)を使用して、動物を(深い麻酔下で)人道的に安楽死させます。 LabChartソフトウェア( 材料の表を参照)を使用してPVデータを分析し、心エコー測定を使用して体積を校正します。

Representative Results

単回併用投与の 4 週間後、i.v. AAV9-cTnT-LDLR および隔週の i.p.P-407注射、心エコー検査は、保存された駆出率、脳室内リラクゼーション時間(IVRT)の延長、E / E ‘、およびE / Aの減少によって証明されるように、HFpEFを明らかにしました(図3A-E)。4週間後のデータと比較すると、8週間後にはより深刻な拡張期機能障害が観察されました。治療の8週間後の圧力-体積(PV)ループ分析では、拡張末期の圧力-体積の関係の傾きの増加が示され、拡張期機能障害の心エコー検査所見を裏付けました(図3F)。注目すべきは、LDLR/P-407による治療後6週間から12週間の間に、LDLR/P-407で治療されたマウスのかなりの数で突然死が発生したことです(図3G)。これらの結果は心血管代謝性HFpEFを示しており、このプロトコルと実験デザインの有効性を確認しています。高脂血症は、LDLR/P407で治療したマウスで4週および8週に認められ、総コレステロール、トリグリセリド、超低密度リポタンパク質(VLDL)、低密度リポタンパク質(LDL)コレステロール、および正常な高密度リポタンパク質コレステロール値の上昇によって証明され、高脂血症の知見を裏付けています(図3H)。 図1:AAV9-cTnT-LDLRのプラスミドマップこの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図2:注入手順. (A)129J株の背景にWTマウスにAAV9-cTnT-LDLRの静脈内(i.v.)尾静脈注射を示す代表的な画像。(B)AAV9-cTnT-LDLRの単回静脈内投与で以前に治療された129J株の背景上のWTマウスでのP-407の腹腔内注射の図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図3:心血管代謝HFpEF.(A-E) LDLR/P-407治療の4週間後(n = 17)および8週間後(n = 11)後に、未治療のマウス(n = 15)と比較した駆出率(HFpEF)が保存された心不全を示す心エコー検査パラメータ。これは、駆出率の維持、等容性緩和時間(IVRT)の延長、E/E’の増加、E/Aの減少、拡張期機能障害のすべての指標によって証明されます。(F)圧力-体積ループの取得と分析により、8週間の治療後に拡張末期血圧-体積関係(EDPVR)の傾きが増加したことが明らかになりました。(G)LDLR/P-407による治療後6週間から12週間の間に突然死が発生した。(H)脂質パネルは、LDLR/P407で治療されたマウスの4週間(n = 4)および8週間(n = 3)での高脂血症の所見を支持し、総コレステロール、トリグリセリド、超低密度リポタンパク質(VLDL)、低密度リポタンパク質(LDL)コレステロール、および正常な高密度リポタンパク質コレステロールレベルの上昇によって証明されました未治療のマウス(n = 5)。±*P < 0.05、**P < 0.01、*** P < 0.001、****P < 0.0001。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Discussion

過去 10 年間で HFpEF の有病率は着実に増加しているにもかかわらず、根底にある病態生理学の具体的な理解は依然としてとらえどころのない^{ままです 13}。さらに、今日の時点では、証拠に基づく治療法は限られています¹³。心血管代謝性HFpEFに関与するメカニズムの理解を深める必要があります。以前に、慢性腎臓病(CKD)も心臓LDLR OEおよびp407注射によって誘発される高血圧も伴わないHFpEFを模倣する高脂血症マウスモデルが導入され^{ました9。}

その結果、心LDLR OEと高脂血症の組み合わせは、^{以前に発表された}9.これらのマウスの心臓、肝臓、骨格筋におけるLDLコレステロールの取り込みの増加と、心臓と肝臓におけるトリグリセリドの減少も観察されました⁹。この方法の利点は、他の高脂血症HFpEFマウスモデルと比較して十分に理解されていない心血管メタボリックシンドロームの経路を調査するための迅速さにあります。たとえば、高脂肪食(HFD)は、発症に最大16週間と20週間かかります¹⁴。このモデルは、開発に4週間かかり、ヒトの代謝異常を模倣します。したがって、このモデルの再現性は不可欠です。

AAV9-cTnT-LDLRおよびP-407の徹底的な準備と投与を確実にすることが不可欠です。このモデルの再現性は、P-407およびAAV9-cTnT-LDLRの濃度と線量の正確な計算、および重量測定に大きく依存します。同様に重要なのは、溶液製剤と適切な静脈内および腹腔内注射技術です。これらの手法の逸脱は、大幅な変更や望ましくない結果をもたらす可能性があります。

このモデルの有効性と効率性にもかかわらず、いくつかの制限があります。静脈内および腹腔内注射を行うには、厳格なトレーニングが必要です。さらに、静脈内および頻繁な腹腔内注射に関連する罹患率および死亡率の潜在的なリスクがあります。静脈内注射を行うとマウスの尾部が損傷する可能性があり、腹腔内注射では盲腸穿刺が発生し、腹膜炎につながる可能性があります¹⁵。これらの怪我は通常、誤った技術によるものであり、実験対象や治療を失う可能性があります。したがって、これらの手順を実行する前に、広範なトレーニングが必要です。別の制限は、このモデルが129J系統に焦点を当てていることです。129J系統を選択した理論的根拠は、未発表の研究で最初に研究したC57BL/6マウスと比較して、この系統でより迅速な拡張期機能障害とHFpEFの所見をもたらした予備研究に由来しています。

これらの制限に関係なく、このモデルにより、HFpEFに関与する根本的なメカニズムと潜在的な効果的な治療オプションについて、より迅速な調査が可能になります。以前の研究では、心血管代謝 HFpEF 誘発性 HFD および N[w]-ニトロ-l-アルギニン メチル エステル (L-NAME) の病態生理学的モデルが 5-15 週間にわたって開発されました¹³。しかし、HFpEFの有病率が着実に増加しているため、心血管代謝HFpEFの病態生理学のさらなる理解と効果的な治療法の開発が急務となっています。この心LDLR OEおよびp407誘発性高脂血症のマウスモデルは、将来の研究努力のために心血管代謝HFpEFを誘導する迅速かつ実行可能な方法です。

Materials

Adeno-associated virus 9-cardiac troponin T-LDLR (AAV9-cTnT-LDLR)	U. Penn Vector Core, funded by the NHLBI Gene Therapy Program (GTRP)		Transgene plasmids and AAVs particles were generated by the U. Penn Vector Core, funded by the NHLBI Gene Therapy Program (GTRP). AAV were provided in Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) with 0.001% Pluronic F68. The Core determined AAV titers by digital droplet polymerase chain reaction (ddPCR) and assessed all preparations for capsid protein ratio by SDS-PAGE and for the presence of endotoxin. Constructs include the human (h) transcripts tagged by 3X HA, Penn Vector Core (RRID: SCR_022432). AAV9-cTNT-hLDLR plasmid encodes the full human LDLR protein (2664bp).
Imaging systems with a high frequency transducer probe MS400	(VisualSonics, Toronto, ON, Canada)	Vevo 2100 or 3100
Isoflurane	Akorn Animal Health, Inc.	NDC: 59399-106-01
LabChart  software	ADInstruments	Pro version 8.1.5
Poloxamer 407	Sigma-Aldrich	16758
PV catheter	Millar Instrument	PVR 1035
Ultrasound analysis software	Vevo Lab
Wild-type (WT) mice on 129J background	Jackson Laboratory