Predição de Alvos de Proteínas e Validação de Compostos de Moléculas Pequenas
Summary
O experimento usado aqui mostra um método de docking molecular combinado com ensaio de deslocamento térmico celular para prever e validar a interação entre pequenas moléculas e alvos proteicos.
Abstract
As proteínas são fundamentais para a fisiologia humana, sendo seus alvos cruciais na pesquisa e no desenvolvimento de medicamentos. A identificação e validação de alvos proteicos cruciais tornaram-se parte integrante do desenvolvimento de medicamentos. O docking molecular é uma ferramenta computacional amplamente utilizada para investigar a ligação proteína-ligante, especialmente no contexto de interações entre drogas e proteínas-alvo. Para a verificação experimental da ligação e para acessar a ligação do medicamento e seu alvo diretamente, é utilizado o método de ensaio de deslocamento térmico celular (CETSA). Este estudo teve como objetivo integrar o docking molecular com o CETSA para prever e validar interações entre drogas e alvos de proteínas vitais. Especificamente, previmos a interação entre xanthatina e a proteína Keap1, bem como seu modo de ligação por meio de análise de docking molecular, seguida de verificação da interação usando o ensaio CETSA. Nossos resultados demonstraram que a xanthatina pode estabelecer ligações de hidrogênio com resíduos de aminoácidos específicos da proteína Keap1 e reduzir a termoestabilidade da proteína Keap1, indicando que a xanthatina pode interagir diretamente com a proteína Keap1.
Introduction
As proteínas são macromoléculas altamente importantes nos organismos vivos e possuem uma gama diversificada de funções únicas dentro das células, como composição da membrana, formação do citoesqueleto, atividade enzimática, transporte, sinalização celular e envolvimento em mecanismos intracelulares e extracelulares 1,2,3. As proteínas manifestam suas funções biológicas principalmente por meio de interações específicas com uma variedade de moléculas, incluindo outras proteínas, ácidos nucléicos, ligantes de moléculas pequenas e íons metálicos 1,4. Os ligantes são pequenos compostos moleculares que se ligam especificamente às proteínas de um organismo. A interação entre proteínas e ligantes ocorre em locais específicos da proteína, chamados de locais de ligação, também conhecidos como bolsas de ligação5. Na pesquisa em química medicinal, o foco está na identificação de proteínas-chave que estão claramente associadas a doenças, que servem como alvos para drogas6. Portanto, obter uma compreensão profunda dos locais de ligação entre proteínas e ligantes é de extrema importância na promoção da descoberta, design e pesquisa de medicamentos 7,8.
O docking molecular é uma ferramenta computacional amplamente utilizada para estudar a ligação proteína-ligante, que emprega as estruturas tridimensionais de proteínas e ligantes para explorar seus modos de ligação primários e afinidades ao formar complexos estáveis 9,10,11. A aplicação da tecnologia de docking molecular originou-se na década de 1970. Com base no princípio de emparelhamento de fechadura e chave e utilizando os algoritmos do software de acoplamento molecular, pode-se determinar a interação entre compostos e alvos moleculares analisando os resultados do encaixe. Essa abordagem permite a previsão de locais de ligação ativos para o composto e a molécula alvo. Consequentemente, facilita a identificação de uma conformação de ligação ideal (aqui chamada de modelo de ligação) para interações ligante-receptor, o que é crucial para a compreensão da mecânica desses engajamentos moleculares 12,13,14,15. Embora o docking molecular forneça previsões valiosas baseadas em computador das interações ligante-receptor, é importante observar que essas são descobertas preliminares. Consequentemente, uma verificação experimental adicional é essencial para confirmar essas interações.
O ensaio de deslocamento térmico celular (CETSA), inicialmente proposto pela equipe de pesquisa de Pär Nordlund em 2013, serve como um método para validar as interações entre drogas e proteínas-alvo. Esta técnica testa especificamente a estabilidade térmica das proteínas-alvo induzidas pela ligação de drogas, fornecendo uma abordagem prática para confirmar interações moleculares 16,17,18. Essa abordagem é baseada no princípio fundamental de que a ligação ao ligante inicia uma mudança térmica dentro das proteínas-alvo e é aplicável a uma ampla gama de amostras biológicas, incluindo lisados celulares, células vivas intactas e tecidos19,20. O CETSA apóia o envolvimento direto do alvo de pequenas moléculas em células intactas, detectando a estabilização termodinâmica de proteínas devido à ligação do ligante e ligando a resposta fenotípica observada ao composto alvo21,22. Dentre as várias metodologias derivadas do CETSA, o Western Blot-CETSA (WB-CETSA) é considerado uma abordagem clássica. Após a preparação da amostra usando o método CETSA, a análise de western blot é utilizada para detectar alterações na estabilidade térmica da proteína alvo. Isso permite a determinação precisa das interações fármaco-proteína dentro dos sistemas celulares17,23.
A xanthatina é um composto bioativo isolado da planta Xanthium L. com propriedades como anti-inflamatória, que tem sido utilizada na medicina tradicional chinesa para tratar doenças como sinusite nasal e artrite24,25. A proteína 1 associada a ECH semelhante a kelch (Keap1) é um componente do complexo proteico de múltiplas subunidades Cullin-RING E3 ubiquitina ligase baseado em Cullin3 e um importante regulador da homeostase redox intracelular, que influencia a intensidade e a duração da resposta inflamatória modulando o estado redox intracelular26. Neste estudo, primeiro utilizamos o docking molecular para investigar a interação entre xanthatin (pequena molécula) e proteína Keap1, com o objetivo de prever seu modo de ligação. Posteriormente, empregamos o método CETSA para validar essa interação, avaliando o impacto da xanthatina na estabilidade térmica da proteína Keap1.
Protocol
Representative Results
Discussion
A identificação de alvos de doenças e a descoberta e desenvolvimento de medicamentos estão intimamente interligadas27. Ao visar precisamente alvos específicos, os candidatos a medicamentos podem ser desenvolvidos para tratar doenças específicas de forma mais eficaz, minimizando simultaneamente os efeitos colaterais associados aos medicamentos28,29. Os alvos mais comumente usados são alvos de proteínas30. No…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82004031) e pelo Programa de Ciência e Tecnologia de Sichuan (2022NSFSC1303). Expressamos nossa grande gratidão a Jiayi Sun no Instituto Inovador de Medicina Chinesa e Farmácia, Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu, pela assistência com western blot.
Materials
| 0.45 μm Polyvinylidene fluoride membrane | Millipore | PR05509 | |
| Anhydrous ethanol | Chron chemicals | 64-17-5 | |
| Bovine serum albumin | BioFroxx | 4240GR100 | |
| Broad-spectrum protease inhibitor mixtures | Boster Biological Technology Co., Ltd | AR1193 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Enhanced chemiluminescence reagent | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0018S | |
| GAPDH antibody | ProteinTech Group Co., Ltd | 10494-1-AP | |
| Gel Imaging Instrument | E-BLOT | Touch Imager Pro | |
| Gradient PCR instrument | Biometra TADVANCED | Biometra Tadvanced 96SG | |
| High-speed freezing centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-30R | |
| Horseradish peroxidase-conjugated affiniPure goat antibody | ProteinTech Group Co., Ltd | SA00001-2 | |
| Isopropyl alcohol | Chron chemicals | 67-63-0 | |
| Keap1 antibody | Zen BioScience Co., Ltd | R26935 | |
| Metal bath | Analytik Jena | TSC | |
| Methanol | Chron chemicals | 67-56-1 | |
| Ncmblot rapid transfer buffer (20×) | NCM Biotech Co., Ltd | WB4600 | |
| Omni-Easy OneStep PAGE gel fast preparation kie | Epizyme Biotech Co., Ltd | PG212 | |
| Phosphate buffer saline | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0021 | |
| Prestained Color Protein Marker | Biosharp | BL741A | |
| Protein Blotting Electrophoresis System | Bio-Rad | MiniPROTEANÒTetra Cell | |
| RAW264.7 cell | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | C7505 | |
| RAW264.7 cell-specific medium | Procell Life Science&Technology Co., Ltd | CM-0597 | |
| SDS-PAGE protein loading buffer | Boster Biological Technology Co., Ltd | AR1112-10 | |
| SDS-PAGE running buffer powder | Servicebio | G2018 | |
| Tris buffered saline powder | Servicebio | G0001 | |
| Tween 20 | BioFroxx | 1247ML100 | |
| Water bath | Memmert | WNE10 | |
| Water purifier | Millipore | Milli- IQ 7005 | |
| Xanthatin | ChemConst Biotechnology Co., Ltd | CONST210706 |
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