Summary

Predicción y validación de dianas proteicas de compuestos de moléculas pequeñas

Published: February 23, 2024
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Summary

El experimento utilizado aquí muestra un método de acoplamiento molecular combinado con un ensayo de desplazamiento térmico celular para predecir y validar la interacción entre moléculas pequeñas y proteínas objetivo.

Abstract

Las proteínas son fundamentales para la fisiología humana, y sus objetivos son cruciales en la investigación y el desarrollo de fármacos. La identificación y validación de dianas proteicas cruciales se ha convertido en una parte integral del desarrollo de fármacos. El acoplamiento molecular es una herramienta computacional ampliamente utilizada para investigar la unión proteína-ligando, especialmente en el contexto de las interacciones entre fármacos y proteínas diana. Para la verificación experimental de la unión y para acceder directamente a la unión del fármaco y su diana, se utiliza el método de ensayo de desplazamiento térmico celular (CETSA). Este estudio tuvo como objetivo integrar el acoplamiento molecular con CETSA para predecir y validar las interacciones entre fármacos y dianas proteicas vitales. En concreto, predijimos la interacción entre la xanthatina y la proteína Keap1, así como su modo de unión, mediante un análisis de acoplamiento molecular, seguido de la verificación de la interacción mediante el ensayo CETSA. Nuestros resultados demostraron que la xanthatina podía establecer enlaces de hidrógeno con residuos de aminoácidos específicos de la proteína Keap1 y reducir la termoestabilidad de la proteína Keap1, lo que indica que la xanthatina podría interactuar directamente con la proteína Keap1.

Introduction

Las proteínas son macromoléculas muy importantes en los organismos vivos y poseen una amplia gama de funciones únicas dentro de las células, como la composición de la membrana, la formación del citoesqueleto, la actividad enzimática, el transporte, la señalización celular y la participación en los mecanismos intracelulares y extracelulares 1,2,3. Las proteínas manifiestan sus funciones biológicas principalmente a través de interacciones específicas con una variedad de moléculas, incluidas otras proteínas, ácidos nucleicos, ligandos de moléculas pequeñas e iones metálicos 1,4. Los ligandos son pequeños compuestos moleculares que se unen específicamente a las proteínas de un organismo. La interacción entre proteínas y ligandos ocurre en sitios específicos de la proteína, llamados sitios de unión, también conocidos como bolsas de unión5. En la investigación en química medicinal, el enfoque radica en la identificación de proteínas clave que están claramente asociadas con enfermedades, que sirven como dianas para los medicamentos6. Por lo tanto, obtener una comprensión profunda de los sitios de unión entre proteínas y ligandos es de suma importancia para promover el descubrimiento, el diseño y la investigación de fármacos 7,8.

El acoplamiento molecular es una herramienta computacional ampliamente utilizada para estudiar la unión proteína-ligando, que emplea las estructuras tridimensionales de proteínas y ligandos para explorar sus principales modos de unión y afinidades al formar complejos estables 9,10,11. La aplicación de la tecnología de acoplamiento molecular se originó en la década de 1970. Sobre la base del principio de emparejamiento de cerradura y llave y utilizando los algoritmos del software de acoplamiento molecular, se puede determinar la interacción entre los compuestos y los objetivos moleculares mediante el análisis de los resultados del acoplamiento. Este enfoque permite la predicción de sitios de unión activos tanto para el compuesto como para la molécula objetivo. En consecuencia, facilita la identificación de una conformación de unión óptima (aquí denominada modelo de unión) para las interacciones ligando-receptor, lo cual es crucial para comprender la mecánica de estos compromisos moleculares 12,13,14,15. Si bien el acoplamiento molecular proporciona valiosas predicciones basadas en computadora de las interacciones ligando-receptor, es importante tener en cuenta que estos son hallazgos preliminares. En consecuencia, es esencial una verificación experimental adicional para confirmar estas interacciones.

El ensayo de desplazamiento térmico celular (CETSA), propuesto inicialmente por el equipo de investigación de Pär Nordlund en 2013, sirve como método para validar las interacciones entre fármacos y proteínas diana. Esta técnica prueba específicamente la estabilidad térmica de las proteínas diana inducida por la unión a fármacos, proporcionando un enfoque práctico para confirmar las interacciones moleculares 16,17,18. Este enfoque se basa en el principio fundamental de que la unión de ligandos inicia un cambio térmico dentro de las proteínas objetivo y es aplicable a una amplia gama de muestras biológicas, incluidos lisados celulares, células vivas intactas y tejidos19,20. CETSA apoya el compromiso directo de pequeñas moléculas diana en células intactas mediante la detección de la estabilización termodinámica de las proteínas debido a la unión de ligandos y la vinculación de la respuesta fenotípica observada con el compuesto diana21,22. Entre las diversas metodologías derivadas de CETSA, el Western Blot-CETSA (WB-CETSA) se considera un enfoque clásico. Después de la preparación de la muestra mediante el método CETSA, se utiliza el análisis de Western blot para detectar alteraciones en la estabilidad térmica de la proteína objetivo. Esto permite determinar con precisión las interacciones fármaco-proteína dentro de los sistemas celulares17,23.

La xanthatina es un compuesto bioactivo aislado de la planta Xanthium L. con propiedades como antiinflamatoria, que se ha utilizado en la medicina tradicional china para tratar enfermedades como la sinusitis nasal y la artritis24,25. La proteína 1 asociada a la ECH similar a las algas kelch (Keap1) es un componente del complejo proteico multi-subunidad de ubiquitina ligasa Cullin-RING E3 basado en Cullin3 y un importante regulador de la homeostasis redox intracelular, que influye en la intensidad y duración de la respuesta inflamatoria mediante la modulación del estado redox intracelular26. En este estudio, primero utilizamos el acoplamiento molecular para investigar la interacción entre la xanthatina (molécula pequeña) y la proteína Keap1, con el objetivo de predecir su modo de unión. Posteriormente, empleamos el método CETSA para validar esta interacción evaluando el impacto de la xanthatina en la estabilidad térmica de la proteína Keap1.

Protocol

1. Descargando las estructuras de xanthatin y Keap1 Abra la base de datos de PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/), ingrese xanthatin (molécula pequeña), luego presione Buscar y haga clic en El primer resultado. Haga clic en Descargar y haga clic en Guardar en estructura 2D para guardar el compuesto en formato .sdf. Descarga la estructura cristalina de la proteína.Abra la base de datos UniProt (https:…

Representative Results

El análisis de acoplamiento molecular predijo la interacción entre la xanthatina y la proteína Keap1. La Figura 2 muestra la formación de enlaces de hidrógeno entre la xanthatina y los residuos de aminoácidos Gly-367 y Val-606 de la proteína Keap1, con una longitud de enlace de hidrógeno de 2,17 Å para Gly-367 y 2,13 Å para Val-606. Además, la puntuación de acoplamiento calculada de -5,69 kcal/mol significa una buena afinidad de unión entre la xanthatina y la proteína Keap1.</p…

Discussion

La identificación de dianas patológicas y el descubrimiento y desarrollo de fármacos están estrechamente interrelacionados27. Al dirigirse con precisión a objetivos específicos, se pueden desarrollar candidatos a fármacos para tratar enfermedades particulares de manera más eficaz y, al mismo tiempo, minimizar los efectos secundarios asociados con los medicamentos28,29. Las dianas más utilizadas son las dianas proteicas<sup class="…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82004031) y el Programa de Ciencia y Tecnología de Sichuan (2022NSFSC1303). Expresamos nuestro gran agradecimiento a Jiayi Sun, del Instituto Innovador de Medicina y Farmacia China de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu, por su ayuda con la mancha occidental.

Materials

0.45 μm Polyvinylidene fluoride membrane Millipore PR05509
Anhydrous ethanol Chron chemicals 64-17-5
Bovine serum albumin BioFroxx 4240GR100
Broad-spectrum protease inhibitor mixtures Boster Biological Technology Co., Ltd AR1193
DMSO Boster Biological Technology Co., Ltd PYG0040
Enhanced chemiluminescence reagent Beyotime Biotechnology Co., Ltd P0018S
GAPDH antibody ProteinTech Group Co., Ltd 10494-1-AP
Gel Imaging Instrument E-BLOT Touch Imager Pro
Gradient PCR instrument Biometra TADVANCED Biometra Tadvanced 96SG
High-speed freezing centrifuge Beckman Coulter Allegra X-30R
Horseradish peroxidase-conjugated affiniPure goat antibody ProteinTech Group Co., Ltd SA00001-2
Isopropyl alcohol  Chron chemicals 67-63-0
Keap1 antibody Zen BioScience Co., Ltd R26935
Metal bath Analytik Jena TSC
Methanol Chron chemicals 67-56-1
Ncmblot rapid transfer buffer (20×) NCM Biotech Co., Ltd WB4600
Omni-Easy OneStep PAGE gel fast preparation kie Epizyme Biotech Co., Ltd PG212
Phosphate buffer saline Boster Biological Technology Co., Ltd PYG0021
Prestained Color Protein Marker Biosharp  BL741A
Protein Blotting Electrophoresis System Bio-Rad MiniPROTEANÒTetra Cell
RAW264.7 cell Beyotime Biotechnology Co., Ltd C7505
RAW264.7 cell-specific medium Procell Life Science&Technology Co., Ltd CM-0597
SDS-PAGE protein loading buffer Boster Biological Technology Co., Ltd AR1112-10
SDS-PAGE running buffer powder Servicebio G2018
Tris buffered saline powder Servicebio G0001
Tween 20 BioFroxx 1247ML100
Water bath Memmert WNE10
Water purifier Millipore Milli- IQ 7005
Xanthatin ChemConst Biotechnology Co., Ltd CONST210706

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Cite This Article
Luo, L., Xiong, J., Tang, Y., Chen, X., Zhang, H. Protein Target Prediction and Validation of Small Molecule Compound. J. Vis. Exp. (204), e66564, doi:10.3791/66564 (2024).

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